Introduction – Situation du sujet
C- Mesures effectuées sur le sérum
Cette étude ayant pour objet l’évaluation du stress latent chez des génisses Prim’holstein, le marqueur du stress choisi, outre des marqueurs urinaires, est la concentration plasmatique de cortisol. De plus nous avons voulu mesurer les concentrations plasmatiques d’hormones thyroïdiennes T3 (triiodothyronine) libre et T4 (thyroxine) libre qui sont le principal facteur influençant la température interne d’un organisme sain afin de relier éventuellement les hyperthermies constatées à une anomalie de fonctionnement de l’axe thyroïdien ou un plus grande sensibilité au stress.
1. Dosage du cortisol plasmatique chez les animaux entre 1 et 70 jours
a- Choix de la technique de dosage
Nous avons utilisé un analyseur Elecsys 1010® (Roche) avec un kit de dosage Cortisol du même laboratoire : Cortisol (11875116 Roche®). Il s’agit d’un test d’électro-chimi-luminescence mettant en jeu le principe de la compétition. L’un des réactifs contient également du Danazol, une molécule qui libère le cortisol endogène de ses protéines de liaison. Le principe de dosage est le suivant.
- Une prise d’essai de 20 µl de sérum ou plasma est incubée avec un anticorps polyclonal (de mouton) anti-cortisol spécifique, marqué à la biotine, et un dérivé du cortisol, marqué avec du ruthénium. Les sites de liaisons libres de l’anticorps sont occupés en partie par du cortisol endogène et en partie par l’haptène marqué. Il se forme des immuncomplexes anti-cortisol en relation avec la concentration de cortisol endogène.
- Des microparticules tapissées de streptavidine sont ajoutées dans la cuvette réactionnelle.
Le complexe immunologique se fixe alors à la phase solide par une liaison streptavidine-biotine.
- Le mélange réactionnel est transféré dans la cellule de mesure, les microparticules sont maintenues au niveau de l’électrode par un aimant. L’élimination de la fraction libre est effectuée par le passage de Procell. Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la production de luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur.
- Les résultats sont obtenus à l’aide d’une courbe de calibration. Une courbe de référence est mémorisée dans le code barres du réactif et est réajustée, pour l’analyseur utilisé, par une calibration en deux points.
b- Caractéristiques du dosage
Les précisions intra- et inter-essai fournies dans la fiche technique sont données pour deux solutions contrôles : respectivement 2,6% et 5,6% pour PCU1 (de valeur 386 nmol/l) et 2,1% et 5,4% pour PCU2 (de valeur 921 nmol/l). Ces deux contrôles sont ceux recommandés par le laboratoire pour l’analyseur utilisé. Le domaine de mesure se situe entre 1,00 et 1750 nmol/l. La limite de détection, ou sensibilité analytique, est de 1 nmol/l ; elle représente la concentration la plus faible de la courbe de référence pouvant être différenciée de 0. La sensibilité fonctionnelle, ici égale à 8 nmol/l est la plus faible concentration que l’on peut détecter avec précision, c’est à dire avec un coefficient de variation inférieur à 20%.
2. Dosage du cortisol plasmatique chez les animaux entre 4 et 18 mois
Choix de la technique de dosage
Ce dosage a été réalisé dans le laboratoire du Dr P Mormède c’est pourquoi il ne s’agit pas de la même technique que pour les animaux en bas âge. Il s’agit d’un dosage radio-immunologique par compétition qui utilise un anticorps du laboratoire, l’anticorps Cortisol Charles 917. Les échantillons sont mis en présence d’une quantité connue de cortisol radioactif puis d’une quantité connue d’anticorps. La lecture se fait par mesure de la radioactivité après ajout d’un liquide de scintillation, et transcription sur des abaques qui la corrèlent à des valeurs de cortisolémie. Les abaques sont préalablement établis à l’aide d’une gamme de plasma porcin dont la cortisolémie est connue. Il s’agit de la méthode utilisée en routine dans ce laboratoire.
3. Dosage de la triiodothyronine (T3) plasmatique libre
a- Choix de la technique de dosage
Nous avons utilisé un analyseur Elecsys 1010® (Roche) avec un kit de dosage FT3 du même laboratoire : FT3-triiodothyronine libre (03051986 Roche®). Il s’agit d’un test d’électro-chimi-luminescence mettant en jeu le principe de la compétition. Le principe de dosage est le suivant.
- Une prise d’essai de 15 µl est mise en présence d’un anticorps polyclonal (de mouton) anti-T3 marqué au ruthénium.
- Puis de la T3 marquée à la biotine et des microparticules tapissées de streptavidine sont ajoutées. L’excès d’anticorps marqué au ruthénium capte la T3 marquée à la biotine. Il se forme un complexe haptène-anticorps. Puis le complexe est fixé à la phase solide par une liaison biotine-streptavidine.
- Le mélange réactionnel est transféré dans la cellule de mesure, les microparticules sont maintenues au niveau de l’électrode par un aimant. L’élimination de la fraction libre est effectuée par le passage de Procell. Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la production de luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur.
- Les résultats sont obtenus à l’aide d’une courbe de calibration. Une courbe de référence est mémorisée dans le code barres du réactif et est réajustée, pour l’analyseur utilisé, par une calibration en deux points.
b- Caractéristiques du dosage
Les précisions intra- et inter-essai fournies dans la fiche technique sont données pour deux solutions contrôles : respectivement 1,7% et 2,2% pour PCU1 (de valeur 4,98 pmol/l) et 1,5% et 1,7% pour PCU2 (de valeur 22,0 pmol/l). Ces deux contrôles sont ceux recommandés par le laboratoire pour l’analyseur utilisé. Le domaine de mesure se situe entre 0,400 à 50,00 pmol/l. La limite de détection, ou sensibilité analytique, est de 0,400 pmol/l ; elle représente la concentration la plus faible de la courbe de référence pouvant être différenciée de 0.
4. Dosage de la thyroxine (T4) plasmatique libre
a- Choix de la technique de dosage
Nous avons utilisé un analyseur Elecsys 1010® (Roche) avec un kit de dosage FT4 du même laboratoire : Thyroxine libre (11731297 Roche®). Il s’agit d’un test d’électro-chimi-luminescence mettant en jeu le principe de la compétition. Le principe de dosage est le suivant.
- Une prise d’essai de 15 µl est mise en présence d’un anticorps anti-T4 marqué au ruthénium.
- Puis de la T4 marquée à la biotine et des microparticules tapissées de streptavidine sont ajoutées. L’excès d’anticorps marqué au ruthénium capte la T4 marquée à la biotine. Il se forme un complexe haptène-anticorps. Le complexe est fixé à la phase solide par une liaison biotine-streptavidine.
- Le mélange réactionnel est transféré dans la cellule de mesure, les microparticules sont maintenues au niveau de l’électrode par un aimant. L’élimination de la fraction libre est effectuée par le passage de Procell. Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la production de luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur.
- Les résultats sont obtenus à l’aide d’une courbe de calibration. Une courbe de référence est mémorisée dans le code barres du réactif et est réajustée, pour l’analyseur utilisé, par une calibration en deux points.
b- Caractéristiques du dosage
Les précisions intra- et inter-essai fournies dans la fiche technique sont données pour deux solutions contrôles : respectivement 1,8% et 2,7% pour PCU1 (de valeur 17,5 pmol/l) et 1,8% et 3,0% pour PCU2 (de valeur 26,1 pmol/l). Ces deux contrôles sont ceux recommandés par le laboratoire pour l’analyseur utilisé. Le domaine de mesure se situe entre 0,300 à 100,0 pmol/l. La limite de détection, ou sensibilité analytique, est de 0,30 pmol/l ; elle représente la concentration la plus faible de la courbe de référence pouvant être différenciée de 0.