Mesures électrophysiologiques

Au moment où nous avons découvert la mutation non-sens chez nos patientes, KCTD7 était décrit comme étant un gène codant potentiellement pour une protéine impliquée dans la tétramérisation des canaux potassiques, mais aucune donnée fonctionnelle n’était accessible pour confirmer cette hypothèse. Considérant le fait que la protéine KCNRG partage plusieurs caractéristiques structurelles communes avec KCTD7, nous avons cherché à comprendre dans quelle mesure la protéine KCTD7 était capable de modifier les courants ioniques transmembranaires intrinsèques à partir de culture primaire de neurones embryonnaires. Ceci soutiendrait l’idée d’un rôle potentiel de KCTD7 qui modifierait la conductance membranaire du potassium. Ce qui serait compatible avec le phénotype diagnostiqué chez nos patientes.

Afin d’évaluer l’influence potentielle de KCTD7 sur l’excitabilité neuronale, des mesures électrophysiologiques ont été réalisées, en collaboration avec le laboratoire du professeur Schiffmann, par Patch Clamp en « cellule entière » sur des neurones corticaux embryonnaires issus de cultures primaires surexprimant à la fois la GFP et KCTD7 à partir du vecteur pCIG2-GFP. L'expression de la GFP indépendante à celle de la protéine d'intérêt facilite l'identification des cellules transfectées avec succès grâce à fluorescence émise par la GFP comme le montre l'image suivante :

Afin de proposer le modèle expérimental le plus proche du cas clinique de nos patients atteints d’épilepsie myoclonique progressive, nous avons choisi les neurones corticaux embryonnaires comme cellules excitables pour notre étude électrophysiologique.

L’excitabilité intrinsèque de ces cellules a été étudiée en courant imposé (ampérage constant) en fixant le potentiel membranaire des cellules -70 mV et en injectant 200 ms de courant dépolarisant de 0 à 380 pA, par 20 pA d’incrémentation. Les données montrent que les neurones corticaux génèrent des pics répétitifs lorsqu’un courant dépolarisant suffisant est injecté. Par ce protocole, nous avons observé que les neurones surexprimant KCTD7 (n=12) présentent un seuil de courant plus élevé pour générer un premier potentiel d’action que les contrôles exprimant la GFP (n=14) : 63.63 ± 5.95 pA et 42.22 ± 6.82 pA, respectivement. L'injection d'un courant en dessous du seuil (200ms de durée et 40pA d'amplitude) induit un déclanchement de potentiels d'action d'une fréquence de 30Hz dans les cellules nerveuses contrôles exprimant la GFP (figure 5a1). En revanche, dans les cellules surexprimant KCTD7, le même courant injecté est incapable de déclencher un seul potentiel d'action (figure 5a2). Autrement dit, la même quantité de courant capable de générer une série de potentiel d’action dans les neurones exprimant la GFP est inférieure au seuil d’activation dans les neurones surexprimant KCTD7.

Dans un second temps, les valeurs groupées (valeurs moyennes + écarts types) des résistances membranaires (R_memb) (figure 5b1) et potentiels de repos (V_rest) (figure 5b2) pour les cellules nerveuses contrôles GFP (colonne blanche) et surexprimant KCTD7 (colonne noire) ont été déterminées en Patch Clamp en potentiel imposé. Nous constatons que la résistance membranaire est plus faible dans les neurones surexprimant KCTD7 (0.87 ± 0.17 GΩ) comparé aux cellules contrôles exprimant la GFP (1.42 ± 0.19 GΩ). De plus, le potentiel de repos des neurones surexprimant KCTD7 est clairement hyperpolarisé (-65.27 ± 1.69 mV) en comparaison avec le groupe de cellules contrôles (-54.02 ± 3.48 mV) (b2). A partir de nos expériences en potentiel imposé, nous avons extrait les valeurs des courants de maintien des potentiels comprises entre -80 et -50mV. Il est intéressant de voir que les courbes I/V suivent la tendance des potentiels de repos mesurés dans la configuration potentiel imposé (figure 5c). Pour le groupe de cellules surexprimant KCTD7 (n=6), la courbe I/V traverse le potentiel zéro à des valeurs plus hyperpolarisées que le groupe contrôle (n=6). Cette valeur est proche de la valeur mesurée précédemment dans des expériences en courants imposés (-65,27mV). Pour le groupe contrôle GFP, ce point inversé est plus dépolarisé. L'ensemble de ces résultats, repris dans la publication 2, est illustré sur la figure suivante :

Chapitre 4

Discussion

Les familles consanguines présentent un profil utile pour déterminer les régions chromosomiques contenant les mutations responsables de maladies génétiques dans le cadre d’une transmission récessive. Ce nouveau locus lié à l’épilepsie myoclonique progressive, nommé à présent EPM3, était jusqu'à peu identifié uniquement dans une seule famille. Cependant, une nouvelle famille a été découverte fin 2010 en Oregon (USA) avec plusieurs enfants souffrant d’un syndrome proche de la famille de notre étude avec pour cause apparente une mutation du gène KCTD7 ⁽¹⁷⁵⁾. Un troisième cas d'épilepsie myoclonique progressive EPM3 a été identifié en Autriche chez un garçon portant une mutation faux sens du gène KCTD7 substituant codon arginine par un codon tryptophane (R94W) au niveau de l'exon 2 du gène sur le domaine BTB/POZ ⁽¹⁷⁶⁾. Ces nouvelles données renforcent très fort la solidité de notre hypothèse de départ quant à l'implication du gène

KCTD7 dans l'épilepsie myoclonique progressive. Nous avons à présent trois cas isolés de EPM3

avec différentes mutations du gène KCTD7.

La mutation homozygote non-sens identifiée sur l’exon 2 du gène KCTD7 chez les trois enfants atteints était hétérozygote chez les parents et les enfants non atteints, et totalement absente sur plus de 100 contrôles analysés dont 50 de la même ethnie. Ces résultats renforcent la probabilité que la mutation non-sens du gène KCTD7 soit le facteur causal de la maladie observée chez les patientes, considérant que la maladie est très probablement monogénique et autosomique récessive. La mise en évidence de cette nouvelle mutation présente un impact direct pour le diagnostique et la physiopathologie des épilepsies myocloniques progressives.

Le gène KCTD7 avait été choisi au départ de notre étude comme gène candidat au séquençage uniquement sur base de son nom, KCTD étant l’acronyme pour K+ Channel Tetramerization

Domain. Comme nous l’avons déjà décrit plus haut, les gènes de la familles des KCTDs sont

impliqués dans des fonctions biologiques très hétérogènes telles que la régulation de la voie Wnt/béta caténine par KCTD15 ⁽¹⁷⁷⁾, l’accélération de la transduction du signal des récepteurs GABA_B via l’activité des protéines G par les KCTD8, 12, 12b et 16 ⁽¹⁴⁹⁾, ou encore la dégradation de l’histone désacétylase HDAC1 (Histone deacetylase 1) par le complexe E3 ubiquitine ligase formé notamment par KCTD11 et la culline-3 ⁽¹⁷⁸⁾.

Suite au manque d’informations disponibles sur le gène KCTD7 au début de notre investigation, notre première étude fonctionnelle sur ce gène a consisté à déterminer son profil d’expression en ARNm sur base d’échantillons d’ARN de souris prélevés sur différents organes. Ces expériences ont montré que l’ARNm de KCTD7 a une expression ubiquitaire, à la fois par Northern Blot et par RT-PCR, confirmant la validité de ces résultats. Même si les protéines KCTDs sont très hétérogènes au niveau de leur fonction, la plupart de leurs gènes sont caractérisées par des profils d’expression ubiquitaires avec une expression majoritaire dans un ou plusieurs organes ⁽¹⁷⁹⁾. Selon les données microarray du GNF Expression Atlas 2, nous retrouvons parmi ces gènes principalement exprimés dans le cerveau ; KCTD1, KCTD2, KCTD4, KCTD6, KCTD7, KCTD13 et

KCTD17. Ces données nécessitent toutefois d’être confirmées par des études plus poussées. Si

l’expression du gène KCTD7 est bien ubiquitaire, comme l'ont montré nos expériences de Northern Blot, il semblerait que ce ne soit pas le cas de sa protéine. En effet, nos Western Blots n'ont montré aucun signal, que ce soit chez l'embryon ou sur différents organes de souris adultes. On ne peut toutefois pas exclure que nos conditions expérimentales soient à l'origine du manque de signal, que la protéine soit présente en dessous du seuil de détection. Il n’est cependant pas rare d’observer ce cas de figure et nous savons que KCTD5 est un gène ubiquitaire quant à l’expression de son ARNm, mais que sa protéine est quant à elle exprimée de manière très spécifique d’après l’étude de Bayon et ses collaborateurs ⁽¹⁵⁵⁾. En effet, en étudiant le profil de la protéine KCTD5, ils ne l’ont détectée qu’après stimulation de lymphocytes périphériques à la phytohémagglutinine (PHA) et l’interleukine 2 (IL-2). Enfin, nous avons montré que le gène KCTD7 est également exprimé durant la vie fœtale par RT-PCR à partir d’échantillons d’embryons de souris broyés à E6.5, E8.5, E10.5, E12.5 et E14.5. Peu d’informations sur le profil d’expression fœtal des autres protéines KCTDs sont disponibles, en grande partie parce que peu d’études se sont penchées sur la question, mais nous savons que KCTD3 ⁽¹⁷⁹⁾, KCTD11 ⁽¹⁷⁸⁾, KCTD12 ⁽¹⁷⁹⁾, KCTD15 ⁽¹⁶⁶⁾ et KCTD16 ⁽¹⁴⁹⁾ ont été détectés durant le cycle embryonnaire. Il est donc possible qu’une importante partie des protéines KCTDs soient déjà exprimées chez l’embryon mais ceci reste à confirmer.

Le projet d’étude japonais intitulé NEDO human cDNA sequencing project ⁽¹⁷¹⁾ a mis en évidence chez l’humain une isoforme alternative du transcrit KCTD7 baptisée AK127790. Cette isoforme alternative identifiée chez l’humain lors de cette étude ne comporte pas encore d’orthologues identifiées chez des espèces tel que le rat, le poisson zèbre, D. melanogaster, C. elegans ou encore S. cerevisiae selon les banques de données UCSC. Aucune étude approfondie sur cette isoforme n'a été faite par la suite, et nous ne pouvons pas exclure que AK127790 ne soit pas un artefact. Nous avons tenté d’amplifier cette isoforme alternative à partir d'échantillons d’ARNm de souris suivant différentes combinaisons exoniques, différentes conditions d’amplification et sur

nous n’excluions pas l’existence de cet isoforme, il semblerait qu’elle ne soit pas détectable chez la souris adulte dans nos conditions expérimentales.

Lorsque nous avons détecté la présence de l’ARNm de KCTD7 sur des échantillons de cerveau murin complet, nous avons cherché à comprendre si cet ARNm était exprimé ou non dans une région spécifique du cerveau. Nous avons donc déterminé par hybridation in situ sur des coupes coronales de cerveau murin P30 (20µm) que cet ARNm semblait être localisé au niveau des cellules mitrales des bulbes olfactifs, des neurones de la région CA1 et CA3 et du gyrus denté de l’hippocampe, des couches profondes du cortex cérébral, et enfin dans la couche de cellules de Purkinje du cervelet. Ces signaux émis par l’hybridation de la sonde anti-sens sont totalement absents lors de l’hybridation de la sonde sens, utilisée principalement comme contrôle négatif en hybridation in situ. Ceci est d’autant plus intéressant qu’un signal pratiquement identique est observé par des expériences d’immunohistochimie lorsque les mêmes coupes coronales de cerveau murin (7µm) sont exposées à un anticorps spécifique contre la protéine KCTD7. Les contrôles positifs et négatifs utilisés lors des immuno-détections confirment la spécificité du signal KCTD7.

Les banques de données de l'Allen Brain Atlas ⁽¹⁸⁰⁾ mentionnent des résultats d'hybridation in situ pour le transcrit KCTD7. Bien sur, nous reconnaissons que ces résultats sont de bonne qualité. Néanmoins, nous émettons deux remarques. Premièrement, la sonde anti-sens qu'ils ont utilisé cible seulement une région lointaine de la portion non codante de l'ARNm KCTD7. Nous pensions donc qu'il était plus significatif de générer une sonde anti-sens ciblant spécifiquement la région codante du transcrit, connue pour être plus conservée, de manière à obtenir le signal le plus spécifique possible. Deuxièmement, leurs expériences n'incluent nullement de sonde sens KCTD7, connue pour être le contrôle négatif classique en hybridation in situ. En effet, cette sonde sens n'a pas été générée d'après la séquence des amorces qu'ils ont utilisé lors des hybridations; l'amorce directe ne contient aucun site promoteur pour la synthèse de la sonde sens, seul l'amorce reverse contient un site promoteur SP6 pour la synthèse de la sonde anti-sens.

Ce profil d’expression de KCTD7 est en accord avec ce qui est observé dans certains cas d’épilepsie myoclonique progressive tel que la maladie d’Unverricht-Lundborg où lors des premières observations neuropathologiques à la fin des années 1960, Haltia et ses collaborateurs confirment l’intégrité du cortex et remarquent des lésions sous corticales : perte des cellules de Purkinje, atteinte discrète du noyau denté, du noyau caudé et du putamen, et atteinte plus importante du noyau médian du thalamus ⁽¹⁸¹⁾. Un model KO de souris Cstb -/- développé par Pennachio et son équipe ⁽¹⁸²⁾ montre l’apparition de convulsions myocloniques, d’ataxie

patients mutés pour le gène KCTD7. On observe dans ce modèle murin Cstb -/- que les jeunes souris (3 à 4 mois) souffrent de neuro-dégénérescence des cellules granulaires du cervelet, de l’hippocampe et du cortex entorhinal. Chez les souris plus âgées (16 à 18 mois), on observe une gliose du néocortex, du striatum, du cortex entorhinal et de l’hippocampe (183). Dia Giaimo et ses collaborateurs ont par ailleurs montré par immunofluorescence en microscopie confocale que la Cystatine B est spécifiquement exprimée par les cellules granulaires et les cellules de Purkinje ⁽¹⁸⁴⁾. Nos marquages sur l’ARNm et la protéine KCTD7 coïncident fort avec ses régions mises en causes dans la maladie d’Unverricht-Lundborg. Notons que les cellules mitrales émettent des projections axoniques en faisceaux, appelés tractus olfactifs, directement vers les structures du cortex entorhinal et l’hippocampe.

N’ayant pas détecté la protéine endogène en Western Blot sur des extraits protéiques à partir des mêmes tissus analysés en Northern Blot, nous avons pensé que la protéine KCTD7 pouvait être hyper labile. En effet, les trois anticorps dirigés contre KCTD7, que nous avons utilisé lors des immuno-détections, n'ont pu déterminé de signal clair sur tous les échantillons protéiques analysés, y compris des extraits de tissus nerveux. Les expériences d'immunohistochimie nous ont montré que KCTD7 est exprimé dans des sous groupes particuliers de cellules, expliquant peut être le fait que KCTD7 soit présent en trop petit quantité dans un échantillons de tissu broyé pour être proprement détecté. Nous avons donc mesuré la demi-vie de la protéine KCTD7 recombinante en cellules COS-7 traitées pour différents temps par la cycloheximide comme inhibiteur de la synthèse protéique. Cette demi-vie a été évaluée à 6h, ce qui indique que KCTD7 n’est pas une protéine hyper labile au point de la rendre indétectable dans nos expériences.

L’absence de signal lorsque nous avons tenté d’exprimer la protéine recombinante muté de KCTD7 nous avait posé problème. Générée au départ pour observer si la troncation du domaine BTB/POZ entraînait une perte totale ou partielle de sa capacité d’interaction, nous souhaitions inclure cette protéine mutante dans des expériences visant à tester sa capacité à former des homodimères, mais également dans nos expériences électrophysiologiques. Si l’action de la forme sauvage de KCTD7 avait bien un effet sur la conductance ionique transmembranaire, il aurait été intéressant de voir si la surexpression de la protéine tronquée entraînait encore partiellement le même effet ou pas. Nous pensions qu’il était possible que cet ARNm mutant soit moins stable que l’ARNm de type sauvage, ce qui expliquerait l’absence de signal. Toutefois, cet ADNc mutant étant exogène et sans intron, son ARNm n’est pas sujet au système de contrôle du NMD puisque cet ARN transcrit ne subit pas d’épissage. Bien sur, il serait très utile d’avoir accès à des échantillons de fibroblates des patientes pour observer ce qu’il advient du transcrit KCTD7 in

de différencier ces cellules en neurones afin d’observer directement les conséquences in vivo de l’absence de KCTD7 sur ces cellules.

Après avoir recueilli les données relatives au profil d’expression de KCTD7, les questions suivantes portaient sur les fonctions de cette protéine. Dans quels compartiments cellulaires exerce-t-elle ses fonctions ? A-t-elle ou non un rôle de régulateur de canal ionique ? Quels sont les partenaires moléculaires avec qui elle interagit ?

Dans un effort de comprendre si KCTD7 avait un effet sur la conductance potassique, nous avons déterminé par des mesures électrophysiologiques que KCTD7 diminue l’excitabilité membranaire. En effet, nos résultats ont montré que les neurones surexprimant KCTD7 présentent un plus grand seuil de courant minimum pour le déclenchement du premier potentiel d’action, une plus faible résistance membranaire et un potentiel de repos plus hyperpolarisé que les cellules contrôles. Ceci explique que la mutation non-sens observée chez nos patients conduisant à un à défaut en KCTD7, suivant le processus de dégradation des ARN non-sens (non-sens mediated mRNA

decay ⁽⁵⁾), engendre à l’inverse une hausse de l’excitabilité membranaire avec un potentiel de repos plus dépolarisé que la normale, le rendant plus proche du seuil de déclenchement du potentiel d’action. Même si ces mesures électrophysiologiques en cellule entière ne nous permettent pas de pointer spécifiquement le type de canal impliqué, tout porte à croire qu’en absence de KCTD7, les neurones sont plus excitables qu’en temps normal.

Dans une autre expérience, nous avons exprimé la protéine recombinante KCTD7 fusionnée à différents tags (GFP, HIS et HA) en cellules COS-7. Après révélation en immunofluorescence, nous avons constaté que ces résultats allaient à l’encontre de ce à quoi nous nous attendions. Partant avec l’hypothèse que KCTD7 soit un régulateur direct de l’activité de canaux potassique, nous nous attendions à observer un signal visible à la membrane plasmique des cellules. Or, nos expériences d’immunofluorescence nous ont montré un marquage cytoplasmique ainsi qu’un signal périnucléaire prédominant en microscopie photonique. L'utilisation en parallèle d'anticorps dirigés soit contre le tag, soit contre la protéine d'intérêt montre un signal fort semblable. Cependant, nous ne pouvons pas totalement exclure que ce signal soit du à l'accumulation dans le réticulum endoplasmique d'une importante quantité de protéines recombinantes, bien que ceci soit peu probable. KCTD7 ne comprenant pas d’étiquette de translocation, il parait peu probable qu’il s’agisse d’une protéine spécifique du réticulum endoplasmique à l’instar de KCNRG. Ce marquage périnucléaire prépondérant résulte sans doute d'un effet d’optique puisque les cellules sont observées d'en haut et que la région du noyau étant plus large que les contours de la cellule. Ceci expliquerait que KCTD7 se retrouve d’avantage près de ce noyau. L'utilisation de co-marqueur d'organelles cellulaires spécifiques pourrait être envisagée, cependant, il serait bon d'y

remédier lorsque la protéine endogène sera clairement identifiée en culture cellulaire. Une culture primaire de cellules nerveuses de l'hippocampe pourrait fournir un bon modèle pour ces marquages. Toutefois, un modèle de régulateur direct de canaux potassiques associés au réticulum endoplasmique a déjà été proposé pour KCNRG (153). Usman et son équipe ont en effet montré que KCNRG co-immunoprécipite avec les sous-unités des canaux Kv1.1 et Kv1.4 via l’interaction de son domaine BTB/POZ mais que cette protéine est localisée dans le réticulum endoplasmique. Dès lors, ils proposent que KCNRG régule négativement l’activité des canaux potassiques par un contrôle de leur expression à la membrane plasmique grâce à leur rétention dans le réticulum endoplasmique. Par conséquent, nous avons postulé que KCTD7 pourrait être un régulateur cytoplasmique direct ou indirect de canaux potassiques.

Une étude de Schwenk et ses collaborateurs a montré que les protéines KCTD8, 12, 12b et 16, ayant chacun un profil d’expression distinct dans le cerveau, sont capables de se lier pour former des tétramères avec les sous-unités du récepteur GABAB afin d’accélérer la transduction du signal relayé par les protéines G vers certains canaux potassiques ⁽¹⁴⁹⁾. En effet, les récepteurs GABAB sont connus pour activer par transduction l’ouverture de certains canaux rectificateurs de courant entrant de K+ conduisant les neurones à un état hyperpolarisé, de manière à empêcher les canaux sodiques de s’ouvrir et aux potentiels d’action d'être déclenchés ⁽¹⁸⁵⁾. Il est cependant peu probable que KCTD7 interagissent directement à la membrane plasmique des cellules que ce soit avec un canal ionique ou un récepteur GABA_B comme le montre nos expériences de d’immunofluorescence caractérisées par un marquage périnucléaire de la protéine et une absence de signal à la membrane. Cependant, ces données ainsi que les études sur KCNRG mettent en