Mesure de l’extinction de la βIII-tubuline par ARN interférents

I. Etude de l’effet de l’extinction de la βIII-tubuline sur des lignées humaines de glioblastomes

I.3. Mesure de l’extinction de la βIII-tubuline par ARN interférents

Afin de disposer de lignées cellulaires exprimant de manière stable des faibles taux de βIII-t, les trois lignées de GB humain ont été infectées avec des particules lentivirales qui expriment une séquence de shARN dirigée contre la βIII-t humaine. Cinq séquences de shARN βIII-t ont été testées selon les indications du fournisseur (Sigma-Aldrich). Après une étape de sélection à la puromycine, nous avons évalué le niveau d’extinction de la βIII-t au niveau de l’ARNm et de la protéine, respectivement par qPCR et par immunoempreinte. De manière comparable, des cellules de ces trois lignées ont été infectées avec des particules exprimant une séquence scrambled ne reconnaissant aucun ARNm humain connu afin d’évaluer les effets potentiels d’une infection lentivirale.

En parallèle des infections lentivirales, nous avons utilisé des siARN dirigés contre la βIII-t afin d’inhiber de manière transitoire l’expression de cette protéine dans les lignées cellulaires en culture. De la même manière, nous avons évalué le niveau d’extinction de la βIII-t en comparaison avec un siARN scrambled (si-Scr) sur les trois lignées cellulaires (Figure 45, Figure 46 et Figure 47).

Tableau 10 : Analyses de corrélation entre la III-t et les facteurs HIF avec le coefficient de corrélation de Spearman

* coefficient  (rho) de Spearman

** Valeur p pour le coefficient rho calculé (en gras, les résultats significatifs pour un seuil de risque =5%)

L’analyse de l’expression des ARNm de βIII-t montre, de manière surprenante, une augmentation de la βIII-t dans les cellules U87-shScr par rapport aux cellules U87 naïves d’environ 3,5 fois. Néanmoins, l’écart-type est élevé en comparaison des autres échantillons, ce qui suggère une variabilité importante de la mesure. De fait, le clone 4 qui présente la meilleure inhibition par rapport aux cellules naïves, éteint d’environ 95% l’expression de la βIII-t comparé aux cellules U87-shScr qui servent de référence. Ce résultat est confirmé au niveau protéique dans les cellules U87-shScr et U87- shβIII-t (clone 4) (Figure 45A et Figure 45B). De plus, l’inhibition de la βIII-t semble induire un changement de morphologie cellulaire. Les cellules U87-shβIII-t présentent un aspect plus arrondi et étalé comparé aux cellules U87-shScr (Figure 45C)

Figure 45 : Caractérisation de l’extinction de la βIII-t sur les cellules U87-MG par stratégie shARN (A, B et C) ou siARN (D et E).

A. Inhibition de l’expression protéique de la βIII-t comparée aux U87-shScr.

B. Détermination des niveaux relatifs d’ARNm de βIII-t dans les 5 clones et sélection du clone n°4. C. Morphologie cellulaire après marquage du cytosquelette à la phalloïdine (rouge) et des noyaux au réactif de Hoechst (bleu) au grossissement X200

D. Détermination des niveaux relatifs d’ARNm de βIII-t 48h après transfection des cellules avec des siRNA dirigés contre la βIII-t et siScr montrant la diminution des ARNm de βIII-t.

Concernant l’inhibition de l’expression de la βIII-t avec des siARN, l’analyse des ARNm de βIII-t n’a montré aucune modification entre les cellules U87 et U87-siScr (Figure 45D). Une inhibition d’environ 90% est mesurée dans les cellules U87-si-βIII-t par rapport aux cellules U87-siScr. Cette inhibition est également confirmée au niveau protéique (Figure 45E).

L’analyse de l’expression des ARNm de βIII-t ne montre pas de différence entre les cellules GL15 et GL15-shScr. L’analyse de l’expression de la βIII-t des 5 clones révèle ici aussi que le clone 4 présente la meilleure inhibition de la βIII-t avec 95% environ par rapport aux cellules GL15-shScr. Une baisse moins importante est observée au niveau protéique (Figure 46A et Figure 46B). Comme observé

Figure 46 : Caractérisation de l’extinction de la βIII-t sur les cellules GL15. A. Inhibition de l’expression protéique de la βIII-t comparée aux GL15-shScr.

D. Détermination des niveaux relatifs d’ARNm de βIII-t 48h après transfection des cellules avec des siRNA dirigés contre la βIII-t et siScr montrant la diminution des ARNm de βIII-t.

précédemment sur la lignée U87-MG, l’inhibition de la βIII-t induit un changement de morphologie cellulaire par rapport aux cellules GL15-shScr (Figure 46C).

Concernant l’inhibition de la βIII-t avec des siARN, une diminution de 90% de l’expression des ARNm de βIII-t est observée. Aucune différence significative de l’expression de l’ARNm de βIII-t n’est mesurée entre GL15 et GL15-siScr (Figure 46D). Cette inhibition est également confirmée au niveau protéique (Figure 46E).

Figure 47 : Caractérisation de l’extinction de la βIII-t sur les cellules U251-MG. A. Inhibition de l’expression protéique de la βIII-t comparée aux U87-shScr.

D. Détermination des niveaux relatifs d’ARNm de βIII-t 48h après transfection des cellules avec des siRNA dirigés contre la βIII-t et siScr montrant la diminution des ARNm de βIII-t.

L’analyse de l’expression des ARNm de βIII-t montre une induction de la βIII-t dans les cellules U251-shScr par rapport aux cellules U251 naïves d’environ 2,2 fois. Comme pour les deux lignées précédentes, le clone 4 présente la meilleure extinction avec une inhibition des ARNm de βIII-t d’environ 95% par rapport aux cellules U251-shScr. Ce résultat est aussi confirmé au niveau protéique (Figure 47A et Figure 47B). Comme pour les deux autres lignées cellulaires, nous observons là aussi un changement de morphologie cellulaire (Figure 47C).

Concernant l’inhibition de la βIII-t avec des siARN, une diminution d’environ 90% de l’expression des ARNm de βIII-t est observée. Aucune différence significative de l’expression de l’ARNm de βIII-t n’est mesurée entre U251MG et U251-siScr (Figure 47D). Cette inhibition est également confirmée au niveau protéique (Figure 47E).

Dans le document Évaluation préclinique de stratégies inhibitrices sélectives de HIF-2α et de la βIII-tubuline pour limiter le développement des glioblastomes et la résistance aux traitements (Page 119-123)