A. Mesure des concentrations d’AMPc et de GMPc, par une technique immuno- enzymatique.
1. Principe
Le dosage des nucléotides cycliques AMPc et GMPc est basé sur la technique de dosage compétitif d’immuno-absorption par enzyme liée (Enzyme-linked immuno assay, ELISA). Les puits de la plaque ELISA utilisée sont recouverts d’un anticorps spécifique des IgG de souris sur lequel vient se fixer un anticorps monoclonal de souris, spécifique de l’AMPc ou du GMPc. Le nucléotide cyclique (AMPc ou GMPc) contenu dans l’échantillon biologique va
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alors se lier d’une manière compétitive à l’anticorps monoclonal en présence d’une quantité déterminée d’AMPc ou de GMPc conjugué à une peroxydase. L’excès de nucléotides cycliques conjugués à l’enzyme est éliminé suite à un lavage de la plaque et l’ajout du substrat permet d’obtenir une coloration dont l’intensité est inversement proportionnelle à la quantité des nucléotides cycliques contenus dans l’échantillon analysé.
2. Préparation des extraits tissulaires et cellulaires
Les nucléotides cycliques ont été extraits à partir d’aortes intactes de rats (SHAM et IC) et de CMLs en culture en utilisant le même tampon de lyse contenant : 0,1 M HCl et 1% Triton X-100. Cependant, le protocole de lyse diffère selon le matériel biologique utilisé :
- Les anneaux aortiques, sont dans un premier temps équilibrés dans la solution de Krebs pendant 1 heure (dans l’incubateur, à 37°C) puis traités avec les inhibiteurs sélectifs de PDEs (1 µM de Cilostamide pour la PDE3 ou 10 µM de Ro-20-1724 pour la PDE4) ou avec le véhicule (0,03% DMSO), pendant 30 minutes. Comme contrôle positif, certains anneaux aortiques sont traités avec l’inhibiteur non-sélectif des PDEs (100 µM IBMX) additionné de L-858051 (10µM L-85) pendant 15 minutes (contrôle positif de la production d’AMPc) ou de sodium nitroprusside (1 µM SNP) pendant 10 minutes (contrôle positif de la production de GMPc). L’inhibiteur de la NOS, le Nω-nitro-L-arginine-methyl ester (300 µM L-NAME) est rajouté dans la solution de Krebs des anneaux aortiques dépourvus d’endothélium "ENDO-", afin de s’affranchir totalement de la voie du NO dans cette condition. Après traitement, les tissus sont directement collectés dans des tubes contenant le tampon de lyse puis congelés dans de l’azote liquide afin de prévenir la dégradation des nucléotides cycliques. Le jour de l’expérience, les tissus sont décongelés sur glace, homogénéisés au moyen d’un broyeur d’échantillons biologiques (Precellys 24, Bertin, Paris, France) et le broyat est ensuite
transféré dans un tube Eppendorf.
- Les CMLs, après 48h de culture dans des boites de Pétri, sont détachées avec de la trypsine, comptées sur une cellule Mallasez puis centrifugées. Le culot est remis en suspension dans le tampon de lyse à 4°C puis transféré dans un tube contenant des billes en céramique (OZYME, Montigny-Le-Bretonneux, France) et homogénéisé avec le même broyeur d’échantillons (Precellys 24). Le broyat est ensuite transféré dans un tube eppendorf.
A partir de cette étape, le protocole est le même pour les extraits tissulaires et cellulaires. Les tubes contenant les lysats sont centrifugés à 12000 g, pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant contenant les nucléotides cycliques est récupéré et utilisé pour le dosage.
3. Dosage immuno-enzymatique
La mesure des concentrations de nucléotides cycliques est réalisée avec un kit immuno- enzymatique pour l’AMPc ou le GMPc (New East Biosciences, King of Prussia, PA, USA).
La mesure de l’absorbance est effectuée au spectrophotomètre (Infinite® M200, TECAN, Lyon, France) à la longueur d’onde de 450 nm. Une gamme étalon de différentes concentrations d’AMPc et de GMPc est réalisée et la droite de standardisation obtenue permet alors de calculer la concentration d’AMPc et de GMPc contenue dans chaque échantillon.
4. Analyse et expression des résultats
- Pour les extraits tissulaires d’aortes de rats : La mesure a été effectuée en l'absence (véhicule : DMSO) ou en présence d'inhibiteurs sélectifs de la PDE3 ou de la PDE4. Ainsi, la concentration des nucléotides dans les anneaux aortiques traités aux inhibiteurs de PDEs est exprimée en pourcentage du niveau basal en présence du véhicule.
- Dans les extraits cellulaires de CMLs : La quantité d’AMPc est déterminée dans chaque échantillon cellulaire puis normalisée à la quantité de protéines mesurée dans chaque échantillon (pmol d’AMPc/µg de protéines).
B. Mesure du taux d’AMPc intracellulaire par imagerie in situ par transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET)
1. Principe de fluorescence
Une molécule fluorescente (fluorophore) possède la propriété d’absorber de l’énergie lumineuse (lumière d’excitation) et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente (lumière d’émission). En effet, lorsque la molécule absorbe un photon, elle change de niveau d’énergie électronique et passe de l’état fondamental S0 à l’état excité S1. Le
retour de la molécule excitée à l’état fondamental peut alors se faire de différentes manières. L’une d’entre elles est l’émission d’un photon, c’est le phénomène de fluorescence (Figure
16). Chaque fluorophore est caractérisé par ses longueurs d’onde d’excitation et d’émission.
En excitation monophotonique, les photons émis ont toujours une longueur d’onde plus grande que les photons absorbés. Ce déplacement du spectre d'émission vers des longueurs d'onde plus élevées, décrit par la loi de Stokes, est essentiel pour la séparation et la détection de la lumière de fluorescence délivrée par le fluorophore (Figure 16).
Le principe de fluorescence est utilisé dans les microscopes à fluorescence et les microscopes confocaux à balayage laser.
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Figure 16 : Diagramme de Jablonski simplifié (A) et déplacement du spectre d’émission de la fluorescence (B). (Szepetiuk et al. 2012)
2. Principe de la technique FRET
Le principe du FRET (Fluoresence resonance energy transfer) a été décrit par Förster en 1948. Il s’agit d’un processus par lequel l'énergie est transférée, de façon non radiative, d'un fluorophore dans un état excité (le donneur) à un second fluorophore (l'accepteur). L'énergie absorbée par le premier fluorophore est dissipée par émission de fluorescence de celui-ci, à moins qu’il ne se trouve à proximité d’un fluorophore accepteur. Un transfert d’énergie de fluorescence du donneur vers l’accepteur résultera en une diminution du signal de fluorescence du donneur et en une augmentation de l’émission de fluorescence de l’accepteur. Les conditions requises pour observer ce phénomène sont définies par le recouvrement du spectre d’émission du donneur et du spectre d’excitation de l’accepteur, la distance entre les fluorophores considérés (<100 Å) et une orientation appropriée des dipôles de transition électronique (Figure 17). Les méthodes permettant de mesurer l’efficacité de ce transfert sont donc particulièrement bien adaptées à l’étude des interactions entre macromolécules. Cette technique est de plus en plus utilisée dans le cadre de la recherche biomédicale et dans la découverte de médicaments grâce à son application au screening à haut débit.
A
Figure 17 : Les conditions requises pour le FRET (exemple de FR
Le transfert d’énergie a lieu entre deux fluorophor recouvre le spectre d’absorption de l’accepteur (A) orientation et une distance (<100 Å) favorables (B)
3. La sonde FRET "Epac2
La sonde FRET utilisée, nommée Epac2 l’AMPc de la protéine Epac, plus précisément de l’i
(Yellow fluorescent protein) sur l’acide glutamique 285
fluorescent protein) sur l’acide glutamique 443
mesurer les taux d’AMPc intracellulaire.
A l’état basal, l’excitation de la CFP à la longueu d’énergie de la CFP vers la YFP qui émet à 535 nm. augmente dans la cellule, la fixation du second mes
la sonde Epac2-camps induit un changement conformationnel de la pr
Les conditions requises pour le FRET (exemple de FRET entre une CFP une YFP).
Le transfert d’énergie a lieu entre deux fluorophores lorsque le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre d’absorption de l’accepteur (A) et lorsque ces fluorophores présentent une orientation et une distance (<100 Å) favorables (B).
La sonde FRET "Epac2-camps"
La sonde FRET utilisée, nommée Epac2-camps, code pour un domaine de liaison à l’AMPc de la protéine Epac, plus précisément de l’isoforme 2B, flanqué du fluorophore YFP
) sur l’acide glutamique 285 et du fluorophore CFP ( ) sur l’acide glutamique 443(Nikolaev et al. 2004). Cette sonde permet de mesurer les taux d’AMPc intracellulaire.
A l’état basal, l’excitation de la CFP à la longueur d’onde de 440 nm conduit à un transfert d’énergie de la CFP vers la YFP qui émet à 535 nm. Lorsque la concentration en AMPc augmente dans la cellule, la fixation du second messager au niveau du domaine de liaison de
camps induit un changement conformationnel de la pr
ET entre une CFP et
es lorsque le spectre d’émission du donneur et lorsque ces fluorophores présentent une
pour un domaine de liaison à soforme 2B, flanqué du fluorophore YFP et du fluorophore CFP (Cyan . Cette sonde permet de r d’onde de 440 nm conduit à un transfert Lorsque la concentration en AMPc sager au niveau du domaine de liaison de camps induit un changement conformationnel de la protéine et un
éloignement des deux fluorophores. Ceci conduit à l
18). Le rapport « fluorescence émise par CFP/fluorescence émise par Y
donc proportionnel à la concentration en AMPc.
Figure 18: Représentation du phénomène de FRET de la sonde Epa
L’augmentation de l’AMPc induit un changement conformatio éloignement des fluorophores CFP et YFP. Ceci condu
4. Installation microscopie FRET
Les cellules sont visualisées à l’aide d’un microsc huile de grossissement X40 relié à une caméra CCD ( SNAP HQ2) commandée par un logiciel (
USA). Les cellules fluorescentes sont sélectionnées et de perfusion externe contenant dans chaque capillai excitée pendant 300 msec par une lampe Xenon (100 W 440/20BP (Band Pass) ainsi qu’un miroir dichroïque d’images (DualView, Hamamatsu) équipé d’un miroir d 480/30 nm (pour la CFP) et 535/25 nm (pour la YFP) YFP. L’acquisition des images par la caméra se fa sont stockées sur le disque dur.
éloignement des deux fluorophores. Ceci conduit à l’arrêt du phénomène de FRET fluorescence émise par CFP/fluorescence émise par YFP
donc proportionnel à la concentration en AMPc.
Représentation du phénomène de FRET de la sonde Epa
Adapté de (Nikolaev et al. 2005)
entation de l’AMPc induit un changement conformationnel de la sonde et un éloignement des fluorophores CFP et YFP. Ceci conduit à l’arrêt du phénomène de FRET.
Installation microscopie FRET
Les cellules sont visualisées à l’aide d’un microscope inversé (Nikon) muni d’un objectif à huile de grossissement X40 relié à une caméra CCD (Cooled charge coupled camera, Cool SNAP HQ2) commandée par un logiciel (Metafluor, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, . Les cellules fluorescentes sont sélectionnées et placées à l’embouchure d’un système de perfusion externe contenant dans chaque capillaire, une solution d’intérêt. La CFP est excitée pendant 300 msec par une lampe Xenon (100 W, Nikon) en utilisant un filtre de 440/20BP (Band Pass) ainsi qu’un miroir dichroïque 455LP (Long Pass). Un séparateur d’images (DualView, Hamamatsu) équipé d’un miroir dichroïque 510LP et de 2 filtres BP 480/30 nm (pour la CFP) et 535/25 nm (pour la YFP) permet de séparer les images CFP et YFP. L’acquisition des images par la caméra se fait toutes les 5 secondes. Toutes les images sont stockées sur le disque dur.
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’arrêt du phénomène de FRET (Figure FP » (CFP/YFP) est
Représentation du phénomène de FRET de la sonde Epac2-camps.
nnel de la sonde et un it à l’arrêt du phénomène de FRET.
ikon) muni d’un objectif à Cooled charge coupled camera, Cool Metafluor, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, s à l’embouchure d’un système re, une solution d’intérêt. La CFP est , Nikon) en utilisant un filtre de 455LP (Long Pass). Un séparateur ichroïque 510LP et de 2 filtres BP permet de séparer les images CFP et it toutes les 5 secondes. Toutes les images
5. Expression de la sonde FRET Epac2-camps
Les CMLs sont ensemencées dans les boites de culture à deux densités cellulaires différentes (Voir paragraphe I.B.2 des Matériel et Méthodes). La sonde FRET Epac2-camps est exprimée grâce à une infection adénovirale réalisée 12 heures après l’ensemencement. Le milieu de culture des cellules est alors remplacé par du milieu contenant l’adénovirus. Les expériences de FRET sont réalisées 48h plus tard.
La quantité d’adénovirus utilisée dépend de la capacité d’infection de celui-ci. Le nombre de particules virales actives par cellule définit la MOI (multiplicité d’infection). Pour un virus donné, la MOI optimale est la MOI minimale permettant d’obtenir une expression de la sonde dans pratiquement 100% des cellules tout en ayant un taux de mortalité due à l’infection minimal. Dans nos expériences, nous avons utilisé une MOI de 500-1500 pfu/cellule sur les cellules ensemencées à faible densité et une MOI de 300 pfu/cellule sur les cellules ensemencées à haute densité.
6. Destruction des structures cavéolaires et validation par un marquage à la filipin III
Dans certaines expériences de FRET, les cellules à haute densité sont traitées avec un agent chélateur de cholestérol, la méthyl- -cyclodextrine (10 µM M CD, solubilisée dans du ringer) pendant 1 heure à 37°C afin de détruire les structures cavéolaires. Pour la condition contrôle, les cellules sont incubées dans les mêmes conditions dans du ringer.
Afin de valider l’effet de ce traitement, un marquage à la filipin III a été réalisé de la manière suivante : Le milieu de culture est changé le lendemain de l’ensemencement des cellules, puis après 48 heures de culture, le milieu de culture est éliminé, et les cellules sont rincées avec du PBS Ca2+/Mg2+. Les cellules sont par la suite traitées avec 10 mM de M CD durant 1 heure, à 37°C. Pour la condition contrôle, les cellules sont incubées dans les mêmes conditions dans du ringer. Les cellules sont par la suite rincées avec du PBS Ca2+/Mg2+ puis
fixées par 4% de PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Une fois fixées, les cellules sont incubées 30 minutes avec 50 mM NH4Cl afin de neutraliser le PFA. Elles sont
ensuite marquées par la filipin III à 0,05 mg/ml (préparée dans du PBS contenant 10% de FBS) durant 2 heures à température ambiante. Les cellules sont enfin rincées avec du PBS, puis observées en microscopie à fluorescence en utilisant un filtre UV (340-380 nm) ainsi qu’un miroir dichroïque 430LP (Long Pass). Les images sont acquises puis stockées sur un disque dur. L’analyse d’image est réalisée à l’aide du logiciel ImageJ qui permet de mesurer
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la fluorescence sur chaque cellule sélectionnée, la fluorescence émise est alors proportionnelle à la quantité de cholestérol dans la cellule. Une diminution du niveau de fluorescence refléterait alors une déplétion du cholestérol et une destruction des structures cavéolaires.
7. Protocole expérimental de FRET
Tout d’abord, le milieu de culture des CMLs est remplacé par une solution physiologique de Ringer dont la composition est détaillée dans le tableau 5 et dans laquelle les cellules sont maintenues tout au long de l’expérience. Les différents agents pharmacologiques utilisés
(Tableau 3) sont préparés dans le Ringer.
Tableau 5: Composition de la solution de Ringer utilisée lors des expériences de FRET. Composé Concentration (en mM)
HEPES 10 NaCl 121,6 Glucose 5 Na pyruvate 5 NaHCO3 4,013 NaH2PO4 0,8 KCl 5,4 CaCl2 1,8 MgCl2 1,8 pH 7,4
Afin d’évaluer l’implication des sous-types de récepteurs β-ARs et des familles de PDEs dans la régulation des signaux AMPc, une stimulation brève à l’isoprénaline (10 ou 100 nM, 15 secondes) en absence ou en présence des inhibiteurs de PDEs et/ou des antagonistes des récepteurs β1 ou β2-AR, est réalisée. Chaque inhibiteur est appliqué de façon continue avant
(pendant 4 minutes pour les inhibiteurs de PDEs et 15 min pour les antagonistes β-ARs) et après le pulse d’isoprénaline.
8. Analyse des données
Les intensités moyennes de la fluorescence émise par la CFP et la YFP sont mesurées dans une région d’intérêt qui comprend l’ensemble de la cellule sélectionnée. Le bruit de fond, mesuré dans une région de l’image ne comprenant pas de cellule, est soustrait à l’intensité de
la CFP et de la YFP. Le chevauchement des spectres d’émission de la CFP et de la YFP, « bleed-through », se traduit par le passage d’une partie de l’émission de la CFP à travers le canal de détection de la YFP. La proportion de ce « bleed-through » dépend des filtres d’émission utilisés. Nous avons exprimé la CFP seule dans nos cellules ce qui nous a permis d’estimer que 50% de la fluorescence de la CFP était mesurée dans le canal YFP. Ainsi le niveau d’AMPc détecté correspond au rapport corrigé CFP/[YFP-(0,5*CFP)].
Les résultats sont exprimés en % d’augmentation par rapport au niveau basal. La réalisation de plusieurs expériences du même type permet de calculer des valeurs moyennes du % d’augmentation CFP/YFP ± ESM. Les paramètres cinétiques des réponses transitoires de l’AMPc sont déterminés par le calcul de l’amplitude maximale du signal, du temps mis pour atteindre l’effet maximum (tmax), du temps mis pour atteindre la moitié de l’effet
maximum (t1/2on), du temps à partir du pic de la réponse pour atteindre la moitié de la
décroissance du signal (t1/2off) en utilisant le logiciel Microsoft Excel (Figure 19). La
moyenne (± ESM) des paramètres cinétiques est calculée pour chaque condition expérimentale.
Figure 19 : Paramètres cinétiques des signaux AMPc en réponse à une stimulation -adrénergique transitoire (pulse d’isoprénaline de 15 sec)
)