3.1.Mesure de la viabilité
La viabilité des bactéries réhydratées a été estimée par la méthode des Unités Formant
Colonies (UFC) après dilutions décimales et étalement sur boites de Pétri. Elle est exprimée
en UFC/mL. Pour chaque dilution, trois boites de Pétri sont ensemencées et les boîtes sont
entreposées dans des enceintes anaérobie (Anaerocult® A, Merck) pendant 48 heures à 37 °C.
Dans le cas de levures déshydratées sur couches minces, la viabilité est exprimée en
UFC/mL/g d’échantillon. Les boîtes sont entreposées pendant 48 heures à 25 °C. Les
expériences ont été répétées au minimum trois fois de manière indépendante.
3.2.Analyse des modifications structurales et fonctionnelles des cellules
3.2.1. Estimation de l’intégrité membranaire (Cytométrie en flux)
L’intégrité membranaire des cellules a été mesurée par cytométrie en flux en marquant
les cellules avec de l’iodure de propidium (IP). L’IP est un agent intercalant de l'ADN, sans
spécificité de base, ne traversant que les membranes cytoplasmiques endommagées, un
phénomène caractéristique de la nécrose cellulaire. Il permet donc de mettre en évidence la
proportion de cellules perméabilisées dans une population. L’IP a une longueur d’onde
maximale d’excitation à 535 nm et d’émission à 617 nm.
La cytométrie en flux permet d'analyser l’ensemble des individus d’une population en un
temps très court. Les bactéries défilent à grande vitesse dans le faisceau d'un laser et trois
paramètres sont ensuite analysés par l'appareil :
la lumière diffusée dans l’axe du rayon incident (FSC), corrélée à la taille de la
bactérie
la diffusion lumineuse à angle droit (SSC), corrélée à la nature du contenu
intracellulaire de la bactérie (granulométrie)
Les analyses ont été réalisées sur un appareil FacsAriaII (Becton Dickinson, San José, Ca,
USA) équipé de deux lasers (488 nm, 20 mW et 633 nm, 20 mW).
Figure 28: Types de réponses obtenues par cytométrie en flux lors du passage de micro-organismes vivants ou morts,
marqués et non marqués à l’IP. Le pourcentage figurant en bleu, exprime la part de cellules présentes dans la porte P3, soit
non marquées à l’IP.
3.2.2. Estimation de l’activité enzymatique (Cytométrie en flux)
La carboxyfluorecéine diacétate (cFDA) permet d'évaluer l’activité enzymatique des
cellules par cytométrie en flux. Elle passe facilement la membrane plasmique (transport
passif) et est clivée en fluorescéine par les estérases des cellules vivantes. La fluorescéine
libre, chargée positivement, sort plus lentement que ne rentre son ester. Elle est donc retenue
dans les cellules vivantes.
Dans cette étude les cellules ont été doublement marquées avec de l’IP et de la cFDA (Figure
29). Pour cela les bactéries ont d’abord été incubées avec de la cFDA (10 µM) pendant 10
minutes, puis centrifugées et remises en suspension dans du tampon (PBS). Les bactéries ont
ensuite été incubées avec de l’IP avant d’être passées en cytométrie. La fluorescence verte
correspondant à la cFDA, a été collectée à l’aide d’un filtre passe-bande de 530 (± 30) nm. La
fluorescence rouge, correspondant à l’IP a été recueillie à l’aide d’un filtre passe-haut de 610
(± 30) nm.
99.9%
98.5%
Intensité de fluorescence
0.2%
100%
Souche vivante Souche vivante + PI
Souche morte Souche morte + PI
Nombre
de
cellules
Figure 29:Type de réponse obtenue par cytométrie en flux lors du passage de micro-organismes marqués avec de l’IP et de la cFDA. Sur le graphique de gauche, chaque évènement est représenté par un point tandis que le graphique de droite exprime
une densité de population.
3.2.3. Dosage de l’oxydation intracellulaire (Spectrofluorimétrie)
La sonde CM-H
2DCFDA (5-(and-6)-chloromethyl-2,7-dichlorodihydrofluorescein
diacetate acetyl ester) a été utilisée pour doser l’oxydation intracellulaire des cellules
bactériennes après séchage à différents niveaux d’a
wet après différents temps de stockage.
Les bactéries ont été mises en contact avec la sonde fluorescente pendant 30 minutes à 37 °C.
Puis les cellules ont été centrifugées et le surnageant a été remplacé par une solution tampon
contenant des protectants (tréhalose + cystéine). Après séchage, les échantillons ont été
réhydratés dans du MRS à 37 °C. Les cellules bactériennes vont ensuite subir 5 cycles de
casse de 40 secondes avant d’être centrifugées de nouveau. La suspension cellulaire marquée
est diluée au centième dans une cuve de spectroscopie. Les mesures ont été effectuées par
spectrométrie de fluorescence à la longueur d’onde d’excitation de 504 nm et la longueur
d’onde d’émission de 524 nm.
3.2.4. Reprise de croissance (Lecteur de plaques)
Le temps de reprise de croissance des bactéries a été mesuré avant et après séchage.
Pour cela, les puits d’une micro-plaque sont remplis avec 180 μL de MRS et 20 μL de
suspension contenant 10
6cellules viables. La densité optique (DO) à 600 nm est ensuite
mesurée par un lecteur de plaque (PARADIGME, Beckman Coulter) toutes les 30 minutes à
37 °C. Après obtention des courbes de croissances, le temps nécessaire pour atteindre le
milieu de la phase exponentielle a été mesuré à l’aide du logiciel Matlab R2011b (fonction
fminsearch).
3.2.5. Observation de bactéries encapsulées (Microscopie confocale)
La microscopie confocale à balayage laser permet de réaliser des images de très faible
profondeur de champ en pratiquant des coupes optiques virtuelles dans l'objet observé. Le
laser est focalisé sur la préparation et seule la zone de focalisation est suffisamment excitée
pour émettre de la fluorescence. Les observations ont été effectuées sur un appareil Nikon
Eclipse TE 2000 U équipé d’une tête confocale multispectrale D Eclipse C1. Les images
fluorescentes et les images en lumière transmises ont été enregistrées et traitées par le logiciel
EZ-C1 3.50 (Nikon).
La microscopie confocale a été utilisée pour localiser les bactéries encapsulées dans une
matrice alginate-protéine de pois. Avant encapsulation les bactéries préalablement lavées ont
été mises en contact avec 0,5 µL/mL d’une solution de SYTO9 (3,34 mM) à l'obscurité,
pendant 20 minutes à température ambiante. Puis les cellules ont été lavées 3 fois et
re-suspendues dans du PBS. Dans le même temps, les protéines de pois ont été marquées avec 10
µ L/mL d'une solution de rhodamine B isothiocyanate (RITC, 1 mg/mL), sous agitation et à
l'obscurité pendant 1h à 4 °C. Les échantillons ont ensuite été mélangés et mis à gélifier entre
lame et lamelle durant 12 heures avant d’être observés.
3.2.6. Observation de micro-domaines Sur7-GFP (Microscopie confocale)
La membrane plasmique des levures contient deux sous-compartiments appelés MCC
(membrane compartment occupied by Can1) et MCP (membrane compartment occupied by
Pma1) (Grossmann et al. 2007). Comme d’autres protéines, la protéine Sur7 est localisée dans
les microdomaines MCC riches en ergostérol. La levure S. cerevisiae WT a été transformée
génétiquement pour greffer une protéine fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein) à la
protéine Sur7 (Dupont et al. 2010).
Figure 30: Répartition des microdomaines Sur7-GFP chez la levure à l’état physiologique (Dupont et al. 2010). Le profil d’intensité de fluorescence, à droite, a été mesuré sur le périmètre de la cellule marquée d’une flèche. Echelle : 5µm.
L’utilisation de la microscopie confocale a permis de visualiser la répartition de la protéine
3.3.Mesure de la fonctionnalité probiotique
3.3.1. Mesure des propriétés immuno-modulatrices
Les propriétés immuno-modulatrices des souches bactériennes ont été étudiées sur des
cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Ces dernières sont conservées dans
l’azote liquide (-196 °C). Les PBMC sont décongelées dans un bain marie à 37 °C, puis
transférées dans du milieu RPMI-1640 (Lonza, Suisse) supplémenté avec 10% de sérum de
veau fœtal (SVF), 1% de L-glutamine (2mM final) et 0,1% d’un mélange
pénicilline/streptavidine (10 U/mL). Enfin, 0,03 mL de DNase (10 mg/mL) sont ajoutés pour
éviter l’agglutination.
Les cellules sont centrifugées deux fois à 200 g pendant 15 minutes, remises en suspension
puis comptées sur une cellule de Malassez. Les PBMC sont ensuite déposées dans une plaque
24 puits à une concentration de 10
6cellules/puits. 10
7bactéries/puits sont ajoutées dans 20 µL
de PBS et le volume est complété à 1 mL (RPMI supplémenté). Les plaques sont alors
incubées dans une étuve à CO
2à 37 °C. Après 24 heures d’incubation, le surnageant est
transféré sur des plaques deepwell pour le dosage des concentrations en IL-10 et IL-12p70 par
la méthode ELISA (Biolegend, USA). Les échantillons sont testés en double.
3.3.2. Mesure de l’hydrophobicité de surface
La méthode d’adhésion à un solvant a été utilisée pour évaluer le caractère
hydrophobe/hydrophile de la surface des cellules avant et après séchage. Le caractère
hydrophobe des bactéries a été mesuré après partition des cellules entre une phase aqueuse et
une phase apolaire d’hexadécane. Les cultures sont lavées deux fois dans du tampon
phosphate (PBS) puis re-suspendues de manière à obtenir une DO de 0,6 à 600 nm (DO 600
initiale
). La suspension bactérienne est alors additionnée de 0,4 mL d’hexadecane puis agitée au
vortex pendant 2 minutes. Les tubes sont laissés à reposer à 37 °C pendant 30 minutes. Après
séparation des différentes phases, l’absorbance de la phase aqueuse est lue à 600 nm (DO 600
finale
). L’affinité des cellules bactériennes pour les solvants est exprimée en pourcentage
d’après la relation suivante :
H(%)=DO 600DO 600
initialeDO 600
finale initiale
Dans le document
Sélection et intégration d'une souche probiotique fonctionnelle dans une matrice sèche
(Page 90-95)