Enfin, dans le but d’évaluer l’impact de l’activité NADPH oxydase réduite sur l’activité bactéricide des neutrophiles in vitro, nous avons mesuré le «killing» de ces cellules vis à vis de S. aureus, C. albicans et E. coli: la Figure 44 montre que l’activité bactéricide des neutrophiles du patient II-2 est superposable à celle d’un patient CGD X0 (caractérisé par l’absence du cytochrome b558): les neutrophiles du patient CGD X- ne sont pas capables de tuer les microorganismes S. aureus e C. albicans, même en prolongeant les temps d’incubation (90 minutes); le «killing» de E. coli, qui est connu pour être indépendant de l’activité NADPH oxydase, est comparable à celui des neutrophiles « control ».
Conclusions
XXXIX
IV. CONCLUSIONS
Dans ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à évaluer finement les mécanismes de bactéricidie des neutrophiles humains; pour cela, nous avons donnés 3 volets à cet étude :
1) Réexaminer les processus de bactéricidie dans les neutrophiles humains normaux, ainsi que dans les neutrophiles de patients atteints de CGD X0 et neutrophiles de patients avec une déficience en MPO.
2) Les mécanismes impliqués dans la bactéricidie des neutrophiles ont été étudié en utilisant également un modèle expérimental très connu en littérature pour les recherches sur le fonctionnement du complexe NADPH oxydase: la lignée cellulaire PLB-985 différentiable en « pseudo-neutrophiles ». En particulier nous avons voulu déterminer si les cellules PLB-985 DloopNox4-Nox2 (dans lesquelles la séquence correspondante à la 2ème boucle intracellulaire de Nox2 a été remplacée par celle de l’oxydase homologue, Nox4), caractérisées par une « super-activité » oxydase, étaient pourvues d’un pouvoir bactéricide augmenté.
3) Nous avons également étudié un cas rare de granulomatose septique chronique, la forme X91-, caractérisé par une activité oxydase réduite (environ 5% du témoin), pour comprendre si cette faible production d’O2.- était suffisante à soutenir l’activité de « killing ».
1) Nous avons d’abord réexaminé les mécanismes impliqués dans la bactéricidie des neutrophiles, sur la base des nouvelles hypothèses récemment proposées (Reeves et al., 2002; Ahliwalia et al., 2004; Segal, 2005) en appliquant la méthode correcte pour la mesure du «killing» des microorganismes récemment mise au point (Decleva et al., 2006). Les résultats que nous avons obtenus démontrent que:
a. L’activité NADPH oxydase est indispensable pour le «killing» de certains microorganismes (tels que S. aureus et C. albicans) mais pas pour d’autres (tels que E.
coli) qui sont efficacement tués même en absence d’explosion respiratoire.
b. Les flux d’ions potassium et l’alcalinisation du pH intraphagosomal, induits par l’activation du complexe oxydase, ne sont pas nécessaires au «killing» de S. aureus et C.
albicans.
c. L’activité antibactérienne NADPH oxydase-dépendante est médiée presque exclusivement par la myeloperoxydase.
d. Les courants d’ions K+ semblent être responsables de l’activité antibactérienne résiduelle des neutrophiles MPO-déficientes, après un long temps d’incubation; ces flux
Conclusions
de potassium seraient toutefois médiés par des canaux autres que ceux identifiés par le groupe du professeur Segal (canaux BKCa) dont la présence n’a pas été confirmée dans les neutrophiles humains.
2) Nous nous sommes ensuite intéressés à l’étude des mécanismes de bactéricidie dans le modèle cellulaire PLB-985 ; les résultats que nous avons obtenus en ce contexte suggèrent que:
a. La production des FRO par la lignée cellulaire PLB-985 en réponse aux stimuli particulaires (microorganismes opsonisés) est sensiblement plus faible que pour les neutrophiles humains.
b. Ce burst respiratoire est responsable d’une activité bactéricide, pour les microorganismes sensibles aux mécanismes de «killing» oxygène-dépendants (S.
aureus e C. albicans), comparable à celle des PMN pour des court temps
d’incubation; toutefois, en prolongeant l’incubation, le pouvoir bactéricide de ce ces cellules est aboli.
c. Par rapport à E. coli, bactérie sensible aux processus de «killing» oxygène-indépendants, l’activité bactéricide des cellules PLB-985 est partiellement déficitaire, comparée aux PMN.
d. La superproduction d’anions superoxyde, mise en évidence dans les cellules PLB-985 DloopNox4-Nox2 en réponse aux stimuli solubles et particulaires (S. aureus, C.
albicans), n’est pas accompagnée par une augmentation de la capacité bactéricides
des cellules vis à vis de S. aureus, C. albicans et E. coli. Ces résultats ont plusieurs explications :
a. dans les cellules PLB-985, les processus bactéricides non oxydatifs sont très diminués, à cause du défaut partiel (MPO, élastase, cathepsine G, β-glucuronidase, lysozyme, CD11b) ou totale (lactoferrine, MMP8, MMP9) des enzymes et des protéines granulaires impliqués dans l’activité bactéricide. Nos résultats suggèrent en particulier un défaut au niveau de la synthèse des granules spécifiques et tertiaires. b. Le contenu en cytochrome b558 des cellules PLB-985 est très faible (un dixième par
rapport aux PMN) à cause de l’absence des granules secondaires, qui constituent le principal réservoir de l’hétérodimère (85%).
3) Le dysfonctionnement du complexe enzymatique de la NADPH oxydase est à la base d’une maladie génétique rare, la granulomatose septique chronique. Nous nous sommes intéressés à la
Conclusions
XLI caractérisation d’un cas atypique de CGD, la forme X91-. Les résultats obtenus nous ont permis de démontrer que:
a. la nouvelle mutation que nous avons identifiée dans le promoteur du gène CYBB (insertion d’une tymidine dans la position -54T/-56T) est responsable de la diminution de l’association des facteurs de transcription de la famille ets avec la région promotrice. Cette mutation empêche donc l’expression normale du gène dans les neutrophiles des patients et détermine une activité oxydase réduite, mesurée dans l’ensemble de la population des granulocytes. b. L’expression et l’activité fonctionnelle de la NADPH oxydase apparait normale dans les
éosinophiles, ce qui indique que l’expression de gp91phox dans ces cellules est régulée par des facteurs de transcription autres que ceux qui opèrent dans les neutrophiles;
c. L’activité oxydase résiduelle (5-7% du control) n’est pas suffisante pour garantir, in vitro, une activité de «killing» vis à vis de S. aureus e C. albicans ni pour protéger le patient des infections sévères et récidivantes, caractéristiques de la CGD.
Introduzione