O processo de extração do óleo de rã-touro apresentou um rendimento de 60 ± 0,9%, ficando próximo dos valores descritos por outros autores (LOPES et al., 2010; MÉNDEZ et al., 1998) que utilizaram temperaturas mais altas para obter o mesmo rendimento. O método de extração a quente apresenta vantagens sobre os métodos que utilizam solventes orgânicos, que são conhecidos pelo impacto negativo sobre a saúde humana e do meio ambiente (NONVIHO et al., 2015). Além disto, o uso destes solventes diminui a qualidade físico-química do óleo devido à maior formação de peróxidos (MACHADO, 2015). Em contra partida, foi relatado um aumento da proporção de ácidos graxos insaturados com o aumento da temperatura durante a extração (MÉNDEZ et al., 1998). Entretanto, este aumento precisa ser controlado pois facilita a degradação dos ácidos graxos insaturados e aumenta os níveis de peróxidos, diminuindo a qualidade do óleo.
A identificação da composição do óleo de rã-touro é importante para predizer suas possíveis propriedades farmacológicas. A tabela 4 apresenta os principais ácidos graxos detectados no óleo de rã-touro. O ácido oleico (18:1 n-9) foi o mais abundante ácido graxo presente no óleo de rã-touro (30 %), apresentando um valor próximo ao relatado em outro estudo (36,3 %) (LOPES et al., 2010). Entre os ácidos graxos saturados, o ácido palmítico (16:0) destaca-se com 10,3%, seguido do ácido esteárico (18:0) com 2,4 % e do ácido mirístico (14:0) com 1,4 %. Entre os ácidos graxos poliinsaturados, o destaque foi para o EPA com 17,5%, mostrando semelhança com os óleos de sardinha (16%) (BIMBO, 1998) e óleos de anchova (22%) (BIMBO, 1998), entretanto, este valor foi maior do que o reportado por Méndez et al. (MÉNDEZ et al., 1998) para o óleo de rã-touro. A elevada quantidade de EPA encontrada no óleo de rã- touro pode estar relacionada com o método de extração, com o tipo de dieta, e com a aclimatação dos anfíbio a baixas temperaturas, o que pode induzir um maior acúmulo de ácidos graxos insaturados no tecido adiposo da rã (COUTINHO, 2002).
Tabela 4- Principais ácidos graxos do óleo de rã-touro Composto Massa molecular Tempo de retenção (min) Àrea % Ácido miristico (14:0) 300 10,35 1,40 Àcido palmitoléico (16:1) 326 12,06 7,71 Ácido palmítico (16:0) 328 12,25 10,32 Ácido eicosapentaenóico (20:5 n-3) 374 13,60 17,59 Ácido oléico (18:1 n-9) 354 13,80 30,0 Àcido esteárico (18:0) 356 14,00 2,47 Ácido araquidônico (20:4 n-6) 376 15,03 0,74 Ácido docosaexaenóico (22:6 n-3) 400 16,51 0,77 ƩSAT - - 24,19 ƩMUFA - - 37.71 ƩPUFA - - 19,10 Colesterol 458 20,62 9,46 Etil iso-allocholate 436 27,76 3,51 Total - - 83,9 Não identificado - - 16,1
No que diz respeito ao DHA, o óleo de rã-touro apresentou 0,77% que foi próximo ao relatado na literatura para o mesmo óleo (MÉNDEZ et al., 1998). Fisiologicamente, tanto o EPA quanto o DHA auxiliam na manutenção da estrutura das membranas celulares e são essenciais para a síntese de lípidos intracelulares da camada córnea da epiderme. Além disso, eles também são precursores de
eicosanóides, que atuam como mediadores anti-inflamatórios, justificando a sua utilização em certas condições inflamatórias em que os seus mecanismos de ação seriam semelhantes a alguns fármacos anti-inflamatórios (KACZMARSKI et al., 2013; KELLEY, 2001).
A Figura 6 apresenta a medida dos parâmetros físico-químicos do óleo de rã- touro durante 120 dias de armazenamento à temperatura ambiente. Os resultados abaixo citados, foram muitas vezes comparados com os valores para óleos de peixe e óleos vegetais, devido à falta de padronização para o óleo de rã-touro.
Figura 6- Propriedades físico-químicas do óleo de rã-touro armazenado à temperatura ambiente durante 120 dias. (A) índice de peróxido, (B) índice de acidez, (C) índice de iodo e (D) índice de saponificação. (*): mudanças significativas.
Imediatamente após a extração, o índice de peróxidos (1,93 ± 0,02 mEq O2/kg de
óleo) da amostra de óleo de rã-touro apresentou-se dentro dos limites estipulados na literatura para os óleos de peixe (≤ 5 mEq/ kg), (BIMBO, 1998; COMMISSION, 2015),
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 30 60 90 120 m e q O 2 / K g ó le o Dias 0 1 2 3 4 5 6 0 30 60 90 120 m g K O H /g ó le o Dias 60 70 80 90 100 110 0 30 60 90 120 g io d o / 1 0 0 g ó le o Dias 150 160 170 180 190 200 210 220 0 30 60 90 120 m g K O H / g ó le o Dias A D B C * * * *
enquanto que para alguns óleos vegetais este valor pode chegar a ≤ 10 mEq/ kg (Figura 6 A) (COMMISSION, 2015). Após 60 dias de armazenamento à temperatura ambiente, o índice de peróxidos aumentou cerca de 2,6 vezes, mas ainda permanecendo dentro dos limites estipulados pelo Codex Alimentarius. No final dos 90 dias de armazenamento, o índice de peróxidos aumentou cerca de 7,2 vezes em relação ao tempo zero, podendo ser devido ao aumento da degradação dos ácidos graxos insaturados por auto-oxidação durante o armazenamento. Entre 90 e 120 dias, a taxa de formação de peróxidos permaneceu constante, o que pode ser atribuído à sua decomposição em estágios mais avançados para formar produtos de oxidação secundários, tais como cetonas e aldeídos responsáveis pelo ranço (RODRIGUES et al., 2015). Desta forma, monitorar a taxa de formação de peróxidos em função do tempo a partir do óleo fresco, é importante para saber em que fase este óleo se encontra. Inicialmente, a taxa de formação de peróxidos é maior que a taxa de degradação, comportamento que se inverte com o passar do tempo.
O índice de acidez revela o estado de conservação do óleo que está diretamente relacionado com a natureza e qualidade do tecido adiposo, com o método de extração, e especialmente com as condições de armazenanamento tanto do tecido adiposo quanto do óleo. Como mostra a Figura 6 B, o índice de acidez imediatamente após a extração foi de 2.956 mg ± 0,01 de KOH / g de óleo, podendo indicar que houve reações de hidrólise durante o armazenamento do tecido adiposo ou extração do óleo. Porém, este valor se manteve constante e dentro dos limites estipulados (≤ 3 mg de KOH / g) até 60 dias de armazenamento à temperatura ambiente, indicando um bom estado de conservação durante este período (COMMISSION, 2015). A partir de 60 dias, um aumento linear de ácidos graxos livres foi observado indicando aumento de reações de hidrólise dos triglicerídios presentes no óleo, com consequente diminuição da sua neutralização (IMMANUEL et al., 2009). O aumento da acidez devido a presença de altos terores de ácidos graxos livres, reduzem a qualidade e o valor comercial do óleo (IMMANUEL et al., 2009). Assim, após 60 dias de armazenamento à temperatura ambiente, este óleo apresentou índice de acidez elevado, podendo este problema ser minimizado através do refino do óleo, adição de antioxidantes e melhores condições de armazenamento tanto do tecido adiposo quanto do óleo (ADEOTI; HAWBOLDT, 2014).
O índice de iodo é uma medida da insaturação dos óleos, baseado na capacidade de reação entre a ligação insaturada carbono-carbono com átomos de halogênio (iodo). O índice de iodo (104,2 ± 1,0 gI /100 g de óleo) obtido após a extração foi próximo aos valores relatados na literatura para alguns óleos derivados de peixe como o óleo de peixe Capelin (95 g I / 100 g de óleo) (BIMBO, 1998), e apresentou maior número de insaturações em comparação com o óleo bruto de tilápia do Nilo (84,5 g I /100 g óleo) (MENEGAZZO et al., 2014). De acordo com a Figura 6 C, durante 60 dias de armazenamento, o índice de iodo do óleo de rã-touro diminuiu 6% em comparação com o óleo fresco, permanecendo dentro dos parâmetros permitido para a maioria dos óleos. Entre 60 e 90 dias o índice de iodo foi reduzido em 16%, podendo ser atribuído a uma maior redução no número de pontos de insaturações como resultado do aumento da oxidação ou quebra do ácido graxo de cadeia longa (ANJUM et al., 2006).
O índice de saponificação (Figura 6 D) é útil para prever o comprimento da cadeia dos ácidos graxos presente no óleo, em que, quanto maior o índice de saponificação menor é o comprimento da cadeia (MORETTO; FETT, 1998). Óleos com altos índices de saponificação são importantes para a indústria alimentícia e cosmética, devido a presença de ácidos graxos com cadeia mais curta, que são menos suscetíveis à deterioração durante o processamento e armazenamento (NYAKUDYA et al., 2015). O índice de saponificação obtido após a extração (171,12 ± 0,9 mg de KOH / g de óleo) foi menor que o relatado para o óleo bruto de tilápia do Nilo (194,9 mg KOH / g de óleo) (MENEGAZZO et al., 2014), indicando que o peso molecular médio dos ácidos graxos presentes no óleo de rã-touro foi maior, podendo ser devido ao método de extração, ao armazenamento e a qualidade do tecido adiposo. No entanto, a partir de 30 dias o índice de saponificação mostrou um aumento acentuado, o que pode ser devido à maior quantidade de ácidos graxos de cadeia curta, mostrando um aumento da degradação do óleo ao longo do tempo. Entretanto, o óleo de rã-touro permaneceu dentro dos valores permitidos para este índice até aproximadamente 90 dias (ANJUM et al., 2006).
Durante 120 dias de análise à temperatura ambiente, foram avaliadas as características organolépticas do óleo de rã-touro puro. Imediatamente após a extração,
este óleo apresentou coloração amarelo claro, transparência e aroma característico, mantido até 90 dias de armazenamento. A partir deste momento, houve um tênue aumento do odor de ranço que pode estar relacionado com a diminuição no valor de peróxidos, sugerindo a decomposição dos peróxidos em aldeídos e cetonas responsáveis pelo odor característico em óleos oxidados (HUANG; SATHIVEL, 2008).
Os óleos e as gorduras têm ângulos específicos de refração, entretanto, uma variação do valor normal pode indicar misturas de óleos ou degradação (IMMANUEL et al., 2009). Neste estudo, o valor do índice de refração foi 1,4701, ficando dentro do intervalo referido na literatura para alguns óleos de peixe e óleos vegetais (SEGURA, 2012; UQUICHE; JERÉZ; ORTÍZ, 2008). Entretanto, não foram encontradas mudanças significativas para este índice após 15 dias de aquecimento a 60 ± 2°C.