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1. Animaux
Des souris knock-out Cav3.2 (Cav3.2-/-, 20-25 g, mâle) et TRPV1 (TRPV1-/-, 20-25 g, mâle), à l'origine générées respectivement par Chen CC et coll.639 et Caterina et coll.428, et leurs littermates sauvages (Cav3.2+/+, TRPV1+/+, 20-25 g, mâle) ont été utilisées. Toutes les expériences ont été effectuées avec l'approbation du Comité d’éthique pour l'expérimentation animale (CEMEA Auvergne; nr: CE 53-12, CE 112-12, CE 24 à 11, CE 13 – 10) et par le Comité d'éthique du IASP. Les animaux ont été logés dans des conditions environnementales contrôlées (21-22°C, 55% d'humidité) et maintenus sous un cycle lumière / obscurité 12 / 12 h. La nourriture et l'eau étaient disponibles ad libitum. Les animaux ont été euthanasiés au CO2.
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2. Etudes comportementales
Les animaux ont été habitués aux tests et / ou { l’enceinte du test avant l’expérimentation. L'expérimentation et l'administration des drogues ont été effectuées en aveugle du génotype des souris et des traitements. L'administration des drogues a été réalisée par une autre personne que l'expérimentateur.
a. Immersion de la patte et de la queue
Les souris ont été habituées à la manipulation pendant trois jours, une semaine avant le test. La queue ou la patte de la souris est immergée dans de l'eau chaude (46°C). La latence de réponse à la stimulation thermique, traduite par une flexion vigoureuse de la queue ou de la patte, a été mesurée trois fois et moyennée. Le cut-off est de 30 secondes, après quoi le membre immergé a été retiré du bain indépendamment de la réponse.
b. Test au formol
Les souris ont été acclimatées à la chambre en plexiglas (30 cm x 30 cm x 30 cm) pendant au moins 30 minutes avant le test. Le formol (20 µl, 2,5% de formol dans une solution saline) a été injecté par voie intraplantaire au niveau la patte arrière. Le comportement de douleur spontanée (léchage) a été enregistré au cours des deux phases nociceptives typiques : de 0 à 5 min (phase 1) et de 15 à 40 min (phase 2) après injection de formol comme précédemment décrit100. Pour les expériences avec l’AM404, seule la phase 1 a été étudiée en raison de la dégradation rapide de l'AM404100.
c. Test de von Frey
Les souris ont été placées dans des compartiments individuels sur le dessus d’une surface grillagée et ensuite laissées en acclimatation pendant une heure avant le test. Les seuils de douleur ont été évalués par le filament von Frey calibré à 1,4 g (Bioseb, France). Ce dernier a été pressé perpendiculairement cinq fois contre le milieu patte et maintenu pendant 3 secondes. Une réponse douloureuse a été notée seulement quand la patte est retirée ou léchée et un score de réponse à la douleur (0-5) est déterminé.
d. Induction du modèle de monoarthrite
Cinq microlitres d'adjuvant complet de Freund (CFA, Difco Laboratories, Detroit, Etats-Unis)640 ont été injectés au niveau des deux côtés de l'articulation de la cheville gauche de la souris sous anesthésie brève (halothane/N2O/O2). Les seuils de retrait de patte suite à une stimulation thermique et mécanique ont été déterminés avant et 7 jours après l'injection de CFA ou de véhicule.
3. Électrophysiologie
a. Culture cellulaire et enregistrements électrophysiologiques
Les DRG ont été disséqués à partir de souris C57BL/6J mâles adultes et une suspension cellulaire a été obtenue suite à une dissociation enzymatique et mécanique. Les enregistrements en whole-cell patch-
clamp ont été réalisés 3-28 h de culture sur des neurones de taille moyenne avec un phénotype "rosette"
précédemment décrit532. Pour l’enregistrement des courants calciques, une solution extracellulaire contenant (en mM) : 2 CaCl2, 100 TEACL, 2 NaCl, 1 MgCl2, 40 choline Cl, 5 glucose, 5 4AP (pH à 7,4 avec
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TEAOH ~ 330 mOsM). Les pipettes avec une résistance de 1-1,5 Mohm ont été remplies avec une solution interne contenant (en mM) : 110 CsCl, 3 MgCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 3 Mg-ATP, GTP 0,6 (pH à 7,4 avec CsOH, ~ 300 mOsM). Tous les enregistrements ont été filtrés à 5 kHz en utilisant un amplificateur 200B Axopatch (Axon Instrument). Les données ont été enregistrées à l'aide du logiciel pClamp10 (Instrument Axon) et analysées par le logiciel Prism Graphpad.
Les cellules HEK exprimant de façon stable la séquence Cav3.2 humaine ont été utilisées comme précédemment descrit532 et ont été transfectées avec des plasmides d'expression de la GFP seul ou avec un mélange de GFP-TRPV1 en utilisant JetPEI.
b. Imagerie calcique
Les cellules humaines embryonnaires de rein, HEK293T, ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% (v/v) de sérum humain, 2 mM de L-glutamine, 2 unités/ml de pénicilline et 2 mg/ml de streptomycine à 37°C avec une humidité contrôlée dans un incubateur avec 10% de CO2. Les HEK293T ont été transfectées de façon transitoire avec le TRPV1 humain en utilisant le vecteur Mirus 293 (Mirus Corporation, Madison, WI, USA). Afin de déterminer si les cellules ont été transfectées, la capsaïcine (1 µM) a été utilisée à la fin de chaque expérience. Les cellules qui ne répondent pas à la capsaïcine, ont été utilisés comme témoins.
Les cellules ont été chargées avec 2 µM Fura-2 acetoxymethyl ester pendant 30 minutes à 37°C. La concentration intracellulaire de calcium a été contrôlée par le rapport des signaux de fluorescence mesurés lors de l'éclairage alternatif à 340 et 380 nm, en utilisant un système MT-10 d'illumination et le logiciel Cell^M (Olympus). La solution de bain contient (en mm) 145 NaCl, KCl 5, 2 CaCl2, 1,5 MgCl2, 10 HEPES, 10 D- glucose, pH = 7,4 tamponnée avec du NaOH.
Comme les cellules HEK expriment la FAAH494, une enzyme qui dégrade l’AM404, les expériences de la figure 29a ont été effectuées en présence d'un inhibiteur de la FAAH (PMSF, 10 µM).
4. Analyses statistiques
Les données sont exprimées en moyenne ± SEM et analysées en utilisant le logiciel SigmaStats 3.5. Les données ont été testées pour la normalité et l’égalité des variances. Les mesures ont été comparées par le test ANOVA à deux voies ou par le test de Kruskal-Wallis ou Friedman dans le cas des données qui ne suivent pas la loi normale. Les comparaisons post hoc ont été réalisées par la méthode de Bonferroni. Les valeurs de p <0,05 sont considérées comme statistiquement significatives.
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