MAT (Modified agglutination test)

Les anticorps IgG dirigés contre T. gondii dans les jus de viande et les sérums ont été recherchés par le test MAT selon le protocole décrit par Desmonts et Remington (Desmonts et Remington, 1980). Le test MAT est utilisé chez les humains et autres espèces animales et implique l'utilisation d'un antigène de T. gondii, du sérum et un tampon contenant du 2-mercaptoéthanol qui contribue à augmenter la sensibilité du test (Desmonts et Remington, 1980).

La lecture des microplaques se fait sur un fond noir pour apercevoir le fond des puits (Desmonts et Remington, 1980). Quand au moins 50% d’un puits est recouvert par un voile d'agglutination opaque, l'échantillon analysé est considéré comme positif (Seefeldt et al., 1989).

Le MAT est un test simple, facile et qui ne nécessite pas de matériels sophistiqués. Des kits commerciaux sont disponibles en vente et sont préférés à l'IFAT et à l’ELISA car ils nécessitent moins de temps de travail (Desmonts et Remington, 1980 ; Seefeldt et al, 1989 ; Shaapan et al, 2008). Le MAT peut a priori être utilisé chez toutes les espèces animales et peut être réalisé sur des échantillons de sérums lysés (Seefeldt et al., 1989).

Le MAT peut également être réalisé sur le jus de viande si le sérum ne peut être récupéré. Cependant, le jus de viande est environ dix fois moins riche en anticorps que le sérum. Le MAT ne détecte que les anticorps de type IgG dirigés contre T. gondii suite à l'utilisation du 2-mercaptoéthanol qui détruit les anticorps IgM (Seefeldt et al, 1989 ; Dubey, 1997). Pour une meilleure interprétation des résultats, il est préférable de tester des échantillons à plusieurs dilutions pour éviter des résultats faussement négatifs (Seefeldt et al., 1989).

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L'antigène de T. gondii (souche RH) a été obtenu à partir du protocole de fabrication d’antigène toxoplasmique mis au point au laboratoire de Parasitologie de l’équipe INSERM UMR-1094. Le protocole est adapté à partir de celui décrit par Desmonts et Remington (Desmonts et Remington, 1980). L’objectif du protocole est de produire des toxoplasmes en grandes quantités afin de pouvoir les utiliser entant qu’antigène pour le test MAT. Ce même antigène peut servir également pour d’autres tests comme l’IFAT avec d’utilisation de lames préparées localement.

Le principe du protocole d’obtention de l’antigène de T. gondii repose sur une co-infection de souris SWISS (20-25 g) par un mélange d’ascite de cellules cancéreuses TG-180 avec une ascite de la souche RH de T. gondii pour une multiplication rapide des parasites. Un entretien des cellules TG-180 est effectué au préalable, les souris SWISS sont inoculées avec les cellules TG-180, puis leurs ascites fraîches sont récupérées à environ 10 jours post-inoculation. De même, l’entretien de la souche RH est effectué en inoculant des souris SWISS avec de l’ascite RH de T. gondii pour obtenir une ascite fraîche. Après comptage sur cellule de Malassez, des souris SWISS saines sont inoculées avec le mélange RH/TG-180 de façon à ce que chaque souris soit inoculée avec 0,2 ml de mélange contenant 1x10⁶ de parasites RH et 1x10⁶ de cellules TG-180.

Des prélèvements d’ascite sont effectués pour vérifier l’état d’infection des cellules TG-180 par la souche RH de T. gondii. La ponction péritonéale totale de l’ascite des souris est ensuite effectuée lorsque le stade 4 ou le stade 5 de l’infection des cellules TG-180 est atteint (Tableau 3). Les souris sont ensuite euthanasiées par injection intramusculaire de 0,5 ml de kétamine (kétamine à 50 mg/ml). L’ascite récoltée est ensuite centrifugée à 700 x g pendant 10 minutes et une étape de trypsination des cellules TG-180 est effectuée en rajoutant au culot une solution de 50 ml de PBS (Phosphate Buffer Saline, pH 7,2 ; BioMérieux, 150mmol/l, réf:75511) contenant 25 mg de trypsine (Trypsin powder, porcine 1:250, SIGMA-ALDRICH) et 0,2 ml d’héparine. Cette étape de trypsination est effectuée dans un bain-marie sous agitation à 37°C.

Tableau 3 : Stades d’infection des cellules TG-180.

Stades d’infection des TG180

Caractéristiques microscopiques

I Pas d’infection des cellules TG-180

II 30% des cellules TG-180 sont infectées

III 80% des cellules TG-180 sont infectées

IV 100% des cellules TG-180 sont infectées et début de lyse cellulaire

V 70% des cellules TG-180 sont lysées avec libération massive de tachyzoïtes

VI Lyse totale des cellules TG-180 et mort de 50% des tachyzoïtes

La trypsination est arrêtée dès que les cellules TG-180 sont détruites pour éviter une plus longue exposition dégradante de la trypsine sur les parasites RH. Les tachyzoïtes sont lavés immédiatement 3 fois en PBS à 700 x g pendant 10 minutes et au final, les tachyzoïtes sont formolés dans du PBS contenant 6% de formaldéhyde pendant au moins 16 heures et stockés à + 4°C. Le formol est ensuite éliminé par 3 lavages en PBS à 700 x g pendant 10 minutes et 0,1% d’azide de sodium est ajouté comme conservateur. La suspension finale est ensuite ajustée à 3x10⁵ tachyzoïtes / µL et est conservée à + 4°C dans le tampon PBS avant utilisation (Figure 9). L’antigène produit est utilisé après une étape de validation.

Validation de l’antigène RH obtenu

Une fois l’antigène RH produit, il est impératif de valider la qualité de cet antigène avant qu’il ne soit utilisé pour le test MAT. Cette étape de validation nécessite de s’assurer de la sensibilité et la spécificité de cet antigène. Un test MAT de validation est alors effectué sur 3 échantillons dont le titre en MAT est connu et validé : un échantillon faiblement positif, un fortement positif et un négatif.

Le but de cette validation est donc de s’assurer que le test est bien spécifique en confirmant le résultat positif ou négatif des échantillons utilisés et de s’assurer de la bonne sensibilité de l’antigène MAT produit en retrouvant un titre égal au titre de l’échantillon faiblement positif.

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Figure 9 : Etapes chronologiques de la fabrication de l’antigène RH de T. gondii.

Détection des anticorps spécifiques à T. gondii par le test MAT

Les échantillons à analyser (sérums ou jus de viandes) avec le test MAT pour détecter les anticorps anti-T. gondii doivent être dilués dans le tampon PBS contenant 0,2 mol/L de 2-mercaptoéthanol. Selon la littérature, plusieurs seuils de positivité ont été rapportés pour détecter les anticorps de T. gondii chez les chevaux (1:20, 1:25 ou 1:40). Nous avons donc défini les dilutions à utiliser pour ce test comme suit : 1:10, 1:20, 1:40, 1:100 et 1:400.

Dans chaque puits à fond rond de la plaque de microtitration, 50 µl de sérums ou jus de viandes dilués ont été déposés avec 50 µl de l’antigène RH dilué dans le tampon BABS (bovine albumin buffered saline) selon les recommandations de l’étape de validation de cet antigène. Les plaques de microtitration sont ensuite recouvertes d’un film autocollant puis incubées à température ambiante à l’abri de la lumière pendant au moins 7 heures. Les tachyzoïtes s’agglutinent en présence de l'immunoglobuline spécifique d'anticorps IgG, le 2-mercaptoéthanol détruit les IgM et est utilisé pour éviter l'agglutination non spécifique.

Un résultat positif se présente avec une formation d’un voile circulaire opaque dont le diamètre est égal ou supérieur à la moitié du diamètre du puits. Cette formation de voile s’explique par l’agglutination qui se crée entre les antigènes de surface de T. gondii et les anticorps spécifiques. Un résultat négatif se traduit par la formation d’un bouton au milieu du puits : il s’agit des tachyzoïtes seuls qui précipitent au fond du puits (Figure 10).

Figure 10 : Représentation des réactions positives avec formation d’un voile opaque à différentes dilutions (1:10, 1:20, 1:40, 1:100) et de la réaction négative avec formation d’un bouton au fond du puits à la dilution 1:400 lors du test MAT.