Matériels et méthodes

Souches bactériennes, huîtres et eau de mer

Deux souches de E. coli STEC ont été sélectionnées parmi la collection de souches environnementales obtenue à partir de l! analyse précédente d! échantillons de coquillages, d! eaux et de sédiments (Publication N°2). La première souche STEC est une souche O100 :HNM stx2+ (code : E. coli stx2) et la seconde une souche O154 :H31 stx1+ (code : E. coli stx1), isolées à partir de lot de coquillages. Deux souches de E. coli non STEC (codes : E. coli 1 et E. coli 2) ont été sélectionnées parmi la collection de souches environnementales obtenue dans le cadre plus global du projet Riskmanche isolées à partir des mêmes lots de coquillages que les souches STEC sélectionnées pour cette étude.

Les huîtres (Crassostrea gigas) de calibre 3-4 provenaient d! une exploitation conchylicole finistérienne (COIC ; Pointe du Château) située en Rade de Brest. Les tests ont été réalisés en Octobre 2014 sur des huîtres maigres en fin de période de ponte.

L! eau de mer utilisée pour les expérimentations a été prèlevée directement à la mer. Les paramètres turbidité, concentrations en ammonium, nitrate, phosphate et chlorophylle A de cette eau de mer ont été mesurés avant son utilisation dans les microcosmes (données non présentées). Pendant l! expérience, les paramètres physico-chimiques de l! eau de mer : le taux d! oxygène, la température, la salinité ont été mesurés à l! aide d! une sonde PT100 et d! un analyseur multiparamètrique (Eutech Instrument PD650 ; ThermoScientific).

Préparation des souches bactériennes et dénombrement des E. coli

Chaque souche a été mise en culture dans un bouillon d! eau peptonée tamponnée, à 37°C pendant 24 heures. Les suspensions bactériennes ont été titrées à l! aide de la méthode de dénombrement E. coli par étalement sur le milieu solide Tryptone-Bile-X-glucuronidase agar (TBX ; AES cheminex, Bruz, France), selon la norme ISO NF-EN-8199. Les suspensions bactériennes ont été préparées à une concentration d! environ 6 log₁₀ UFC/100 mL (10 mL de suspension bactérienne) pour avoir une contamination de l! eau mer d! environ 4 log₁₀ UFC/100 mL une fois la suspension bactérienne versée dans le bac.

La numération des E. coli dans l! eau de mer a été réalisée par filtration de 1, 10, 100 ou 500 mL d! eau sur membrane 0,45 µm (Pall Gelman GN-6 Metrocel : Pall Corporation, St Germin-en-Laye, France) et le dépot du filtre sur le milieu TBX, incubé 24h à 44°C ; inspiré des normes ISO NF-EN-8199 et ISO TS-16649-3:2005. La concentration en E. coli réelle dans les bacs de contamination à T0 a été mesurée après quelques minutes d! homogénéisation de l! eau de mer avec la suspension bactérienne titrée versée. La numération des E. coli dans les huîtres a été réalisée par impédancemétrie selon la norme NF V 08-106.

115 Infrastructures et organisation

L! étude de la cinétique de contamination et de décontamination a été réalisée en collaboration avec l! autre partie de l! équipe du laboratoire LSEM (Brest) localisé sur le site Ifremer de Nantes. L! équipe de Nantes disposait des infrastructures adaptées à ce genre d! expérimentation. Les cultures bactériennes ont été préparées au laboratoire Ifremer de Plouzané et les suspensions à Nantes. Cette répartition des tâches a nécessité l! élaboration d! un planning prenant en considération la préparation des souches bactériennes, le temps d! acheminement des coquillages, leur acclimatation en eau de mer (minimum 24 heures) et la mise en place des expérimentations de contamination/décontamination pour les deux types de souches STEC et non STEC sélectionnées. Les souches ont été testées par couple soit les souches E. coli stx1 et E. coli 1 ou E. coli stx2 et E. coli 2, en parallèle.

De plus, des essais préalables de suivi de croissance en cultures successives des souches sélectionnées dans les conditions d! expérimentations (préparation, expédition, conservation) ont permis de montrer que l! organisation générale de l! expérience n! avait pas d! impact sur la cinétique de croissance des E. coli (données non présentées). Les tests préliminaires sur la réponse des souches sélectionnées à l! analyse par impédancemétrie ont également montré une bonne sensibilité de la méthode pour la détection des souches (données non présentées).

Expérience de biaccumulation

L! étude de la cinétique de contamination et de décontamination des huîtres a été réalisée pendant 24 heures.

Lors de la phase de contamination, les essais ont été réalisés en triplicat dans des bacs de 30 litres d! eau de mer (Bac A, B et C) avec un nombre de 30 huîtres par bac. Des dispositifs d! oxygénation d! aquarium ont été placés dans chaque bac pour l! oxygénation de l! eau et le maintien d! un courant d! eau continu dans les bacs.

La mesure de la concentration en E. coli réelle à T0 a montré que les bacs d! eau de mer ont été contaminés à hauteur de :

• souche E. coli stx1 : 4,1 log₁₀ UFC/100 mL d! eau de mer (A), 4,2 log₁₀ UFC/100 mL (B) et 6,1 log₁₀ UFC/100 mL (C)

• souche E. coli stx2 : 4,1 log10 UFC/100 mL pour les 3 bacs (A, B et C)

• souche E. coli 1 : 7 log10 UFC/100 mL (A), 3,9 log10 UFC/100 mL (B) et 5,7 log10 UCF/100 mL (C)

• souche E. coli 2 : 4,2 log10 UFC/mL (A), 4,2 log10 UFC/mL (B) et 4 log10 UFC/mL (C)

Un prélèvement de six huîtres a été effectué à T0 (avant contamination) à partir du lot entier dans le bac d! acclimatation, puis à T2h et à T5h dans chaque bac de contamination (triplicat A, B et C) pour étudier la phase de contamination.

116 Pour la phase de décontamination, après le T5h, les huîtres ont été rincées rapidement à l! eau douce (eau du robinet) avant d! être ré-immergées dans deux bacs de 300 litres d! une nouvelle eau de mer : un bac pour les huîtres contaminées avec une souche STEC et un bac pour les huîtres contaminées avec une souche non STEC. Pour des raisons pratiques, toutes les huîtres contaminées par une souche STEC issues des triplicats A, B et C de contamination ont été rassemblées dans un même bac mais en ne modifiant pas la répartition des huîtres dans les paniers A, B et C (triplicat de contamination) de même pour les huîtres contaminées avec une souche non STEC (Figure 24).

Un prélèvement de six huîtres a été effectué à T10h et à T24h pour étudier la phase de décontamination.

Les temps de prélèvement ont été choisis en fonction des trois répétitions de test réalisés préalablement (données non présentées). Les résultats préliminaires ont mis en évidence que les temps T0, T2h, T5h, T10h et T24h suffisaient pour avoir un bon aperçu de la cinétique de contamination et de décontamination des huîtres. De plus, il était difficile d! augmenter le nombre de prélèvement pour des raisons pratiques (nombre d! échantillons analysables en 24h limité ; capacité d! analyses par impédancemétrie).

Figure 24 : Organisation du suivi de la cinétique de contamination et de décontamination d! huîtres au contact d! une souche de E. coli (E. coli stx1 ou E. coli stx2 ou E. coli 1 ou E. coli 2)

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