Matériels et Méthodes :

2.1 Anticorps primaires et secondaires :

Concernant l’évaluation par immunobuvardage de type Western de l’effet de l‘extrait sur l’expression et la localisation subcellulaire de SAM68, l’anticorps primaire anti-SAM68 utilisé était un anticorps monoclonal anti-SAM68 (sc-1238) provenant de Santa Cruz Biotechnology [SAM68 clone 7-1 (sc-

1238) mouse monoclonal IgG]. Cet anticorps est spécifiquement dirigé contre les acides aminés 331

à 443 de la protéine. L’anticorps secondaire correspondant était un anticorps anti-souris couplé à la peroxidase de raifort (HRP), provenant de Jackson Immunoresearch. L’anticorps primaire utilisé pour contrôler la charge de matériel protéique testé, était un anticorps polyclonal anti-β-actine provenant de Santa Cruz Biotechnology [Actin (I-19) sc1616]. L’anticorps secondaire correspondant était un anticorps anti-chèvre couplé à la peroxidase de raifort.

2.2 Lignée utilisée et culture cellulaire :

Les expérimentations concernant l’évaluation par immunobuvardage de type Western de l’effet de l’extrait sur l’expression et la localisation subcellulaire de SAM68 ont été effectuées à partir de la lignée cellulaire A549, une lignée d’adénocarcinome pulmonaire humain obtenue auprès de l’American Type

Culture Collection. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum de

veau fœtal, 1% de mélange multi-vitaminique et 1% d’un mélange d’antibiotique contenant les mêmes proportions de pénicilline et de streptomycine. Tout au long de la culture, les cellules ont été

76

2.3 Stimulation des A549 et évaluation de l’effet de l’extrait sur l’expression de la forme native de SAM68 par immunobuvardage de type Western:

Les cellules ont été ensemencées en plaque 6 puits à raison de 3x105 _{cellules par puits et incubées}

une nuit à 37°C et 5% de CO2 pour permettre l’adhésion cellulaire. Les cellules ont ensuite été

stimulées pendant 6, 8 ou 12h au DMSO ou au milieu de culture seul (contrôles négatifs) ou encore à des concentrations croissantes (0,5; 2,5 ou 5 µg/mL) d’extrait, préalablement dissout dans du DMSO, puis ajouté au milieu de culture à hauteur d’une concentration finale de 0,5% v/v, afin de prévenir d’une éventuelle cytotoxicité liée au solvant. Pendant toute la durée de stimulation, les cellules ont été

maintenues à l’incubation sous 37°C et 5% de CO2.

Une fois la stimulation terminée, les milieux de culture respectifs ont été prélevés, les tapis cellulaires ont été rincés au PBS 1X puis les cellules ont été récoltées par trypsinisation. A ce stade, un compte cellulaire a été effectué par test d’exclusion au bleu trypan, afin de standardiser tous les échantillons

à 3x105 _{A549. Chaque échantillon a ensuite été lavé avec du PBS1X puis centrifugé à 300xg pendant}

1 minute à 4°C. Les culots ont ensuite été resuspendus dans une proportion égale de PBS 1X et de tampon de Laemmli 2X bouillant dont la composition est indiquée au tableau 4, ci-dessous.

Tableau 4. Composition du tampon de Laemmli 2X.

Composants Concentration finale

Tris-HCl, pH 6,8 125 mM

SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 8%

β-Mercaptoéthanol 10%

Glycérol 17%

Orthovanadate 5 mM

Aprotinine et Leupeptine 20 µg/mL

Bleu de bromophénol 0,5%

Les échantillons ont ensuite été vortexés, bouillis à 95°C pendant 7 minutes, puis centrifugés brièvement afin d’en faire redescendre la condensation. Les échantillons ont ensuite été soumis à électrophorèse en SDS-PAGE en utilisant un gel de séparation des protéines contenant un gradient

77 d’acrylamide de 7,5-20% et un gel d’empilement contenant 4,32% d’acrylamide. Après électrophorèse, les protéines ont ensuite été transférées sur membrane de PVDF (Polyfluorure de vinylidène). L’immunobuvardage de type Western été réalisé après blocage de la membrane de transfert dans une solution contenant 5% p/v de lait en poudre dilué dans du TBS-Tween 0,15% v/v, lavage avec du TBS- Tween 0,15% v/v puis utilisation des anticorps primaires anti-SAM68 (sc-1238), décris plus haut, dilués à 1 :500 dans du TBS-Tween 0,15% v/v. Les anticorps secondaires anti-souris (cf. plus haut) utilisés ont été dilués à 1:10000 dans du TBS-Tween 0,15% v/v et la révélation a été effectuée par

chimioluminescence en utilisant une solution d’ECL (Enhanced chemiluminescent). Les bandes

obtenues ont été analysées en utilisant le logiciel Image J 1.48 (Wayne Rasband, National Institutes of Health). Les valeurs de densitométrie obtenues pour SAM68, normalisées en utilisant les valeurs de densitométrie obtenues pour le témoin de charge, la β-Actine, ont été exprimées sous forme d’intensités relatives en considérant les échantillons stimulés au DMSO (contrôle négatif) comme valeur standard.

2.4 Stimulation des A549 et évaluation de l’effet de l’extrait sur la localisation

subcellulaire de la forme native de SAM68 par immunobuvardage de type Western:

Les cellules ont été ensemencées en plaque 6 puits à raison de 3x105 _{cellules par puits et placées une}

nuit à l’incubation sous 37°C et 5% de CO2 pour adhésion. Les cellules ont ensuite été stimulées

pendant 6h au DMSO ou au milieu de culture seul (contrôles négatifs) ou encore à des concentrations croissantes (0,5; 2,5 ou 5 µg/mL) d’extrait, préalablement dissout dans du DMSO, puis ajouté au milieu de culture à hauteur d’une concentration finale de 0,5% v/v, afin de prévenir d’une éventuelle cytotoxicité liée au solvant. Pendant toute la durée de stimulation, les cellules ont été maintenues à

l’incubation sous 37°C et 5% de CO2.

Une fois la stimulation terminée, les milieux de culture respectifs ont été prélevés, les tapis cellulaires ont été rincés au PBS 1X puis les cellules ont été récoltées par trypsinisation. À ce stade, un compte cellulaire a été effectué par test d’exclusion au bleu trypan, afin de standardiser tous les échantillons

à 3x105 _{A549. Chaque échantillon a ensuite été lavé avec du PBS1X puis centrifugé à 300xg pendant}

78

de tampon de Laemmli 2X bouillant (cf. tableau 6) puis bouillis pendant 7 minutes à 95°C, soit dans une proportion égale de tampon de lyse hypotonique dont la composition est indiqué au tableau 5 ci- après puis placés pendant 5 minutes à 4°C.

Tableau 5. Composition du tampon de lyse hypotonique.

Composants Concentration finale

NP40 0,1% Tris HCl pH 7,4 20 mM NaCl 10 mM EDTA pH 7,4 1 mM Orthovanadate 2 mM Aprotinine et Leupeptine 10 µg/mL PMSF 2 mM

SBTI (Soybean trypsin inhibitor) 50 µg/mL

Les échantillons lysés à 4°C dans le tampon de lyse hypotonique ont été centrifugés à 400xg pendant 10 minutes. Une proportion égale de surnageant a été ajoutée à une proportion égale de tampon de Laemmli 2X bouillant. Ces échantillons représentent les fractions cytoplasmiques. Les culots ont quant à eux été resuspendus dans du tampon de lyse hypotonique puis mélangés à une proportion équivalente de tampon de Laemmli 2X bouillant. Ces échantillons représentent les fractions nucléaires. Les échantillons représentant les fractions nucléaires et cytoplasmiques ainsi que les lysats cellulaires totaux ont ensuite été vortexés, bouillis à 95°C pendant 7 minutes, puis centrifugés brièvement afin d’en faire redescendre la condensation. Les échantillons ont ensuite été soumis à électrophorèse en SDS-PAGE en utilisant un gel de séparation des protéines contenant un gradient d’acrylamide de 7,5- 20% et un gel d’empilement contenant 4,32% d’acrylamide. Après électrophorèse, les protéines ont ensuite été transférées sur membrane de PVDF.

79 L’immunobuvardage de type Western a été réalisé après blocage de la membrane de transfert dans une solution contenant 5% p/v de lait en poudre dilué dans du TBS-Tween 0,15% v/v, lavage avec du TBS-Tween 0,15% v/v puis utilisation des anticorps primaires anti-SAM68 (sc-1238), décris plus haut, dilués à 1 :500 dans du TBS-Tween 0,15% v/v. Les anticorps secondaires anti-souris (cf. plus haut) utilisés ont été dilués à 1:10000 dans du TBS-Tween 0,15% v/v et la révélation a été effectuée par

chimioluminescence en utilisant une solution d’ECL (Enhanced chemiluminescent). Les bandes

obtenues ont été analysées en utilisant le logiciel Image J 1.48 (Wayne Rasband, National Institutes of Health). Les valeurs de densitométrie obtenues pour SAM68, normalisées en utilisant les valeurs de densitométrie obtenues pour le témoin de charge, la β-Actine, ont été exprimées sous forme d’intensités relatives en considérant les échantillons stimulés au DMSO (contrôle négatif) comme valeur standard.

2.5 Contrôle des charges par évaluation des niveaux de β-Actine après détachement des anticorps des membranes:

Pour les deux types d’expérimentations, le contrôle des niveaux de protéines chargées a été effectué après détachements des anticorps des membranes puis incubation avec un anticorps primaire anti-β- actine (cf. plus haut). Brièvement, les membranes ont subi une série de lavage au TBS-Tween 0,15% v/v puis mises en contact pendant 15 minutes, avec une solution de détachement des anticorps douce, provenant de Thermo Fisher scientific Incorporation. Les membranes ont ensuite été lavées puis bloquées avec une solution de TBS-Tween 0,15% v/v contenant 5% p/v de lait en poudre. Les immunobuvardages des membranes ont été effectués à nouveau en utilisant des anticorps anti- β- actine dilués à 1 :1000 dans du TBS-Tween 0,15 % v/v puis des anticorps secondaires anti-chèvre couplés à la HRP. La révélation a été effectuée par chimioluminescence en utilisant une solution d’ECL

(Enhanced chemiluminescent). Les bandes obtenues ont été analysées en utilisant le logiciel Image J

80