CHAPITRE 4 : Matériel végétal et techniques utilisées
4.1. - Matériel végétal
Les espèces étudiées, classées selon la systématique de Ietswaart [68] et identifiées par M. Pasquier du CNPMAI proviennent de graines récoltées dans des pays du pourtour méditerranéen entre 1997 et 2004. Le lieu géographique précis est repéré par un numéro de population unique. Ces graines ont été semées au CNPMAI, les plants obtenus ont ensuite été repiqués en terre sur le site du CNPMAI.
En 1999, les espèces étudiées ont été plantées suivant le bloc de Fischer, en 3 répétitions R1, R2 et R3 (chaque répétition comprenant 20 pieds). Les huiles ont été obtenues à partir de l'ensemble des pieds de chaque répétition. Il faut noter que certaines espèces ne se sont pas développées correctement et qu’en conséquence nous ne possédons pas les 3 répétitions.
La culture de certaines de ces espèces s’est prolongée en 2000 ; l’huile essentielle est obtenue par hydrodistillation à partir de chaque pied. D’autres espèces ont été plantées et récoltées en 2000, l’huile essentielle a été obtenue à partir de chaque pied récolté (ces échantillons seront notés 2000B).
En 2001, 2002 et 2004 d'autres espèces ont été plantées, récoltées et extraites par hydrodistillation réalisée à partir de chaque pied.
Ainsi, toutes les espèces d'origan étudiées proviennent de cultures soumises au "climat de l'Ile de France" sauf O. grosii qui a été récolté dans le parc de Talasemtane dans le Rif marocain par M. Schoeffert du CFPPA (Centre de Formation Professionnelle et de Promotion Agricole - 26110 Nyons).
Pour chaque année de récolte, le nombre d'échantillons est de :
- 1999 : 176 échantillons - 2000 : 240 échantillons - 2000B : 80 échantillons - 2001 : 110 échantillons - 2002 : 26 échantillons - 2004 : 21 échantillons
Sur la totalité des 653 échantillons d'huiles essentielles fournis par le CNPMAI, seuls 457 ont pu être analysés en chromatographie en phase gazeuse ; les autres échantillons n’ont pas pu être analysés faute d’une quantité suffisante d’huile.
Pour une plus grande compréhension, un tableau synoptique reprenant les noms des populations, les lieux de cueillettes, les années de récoltes etc…, est établi pour chaque espèce étudiée.
4.2. - Conditions d’obtention des huiles essentielles
Les parties aériennes des origans ont été récoltées au stade pleine floraison. Toutes les huiles essentielles analysées dans ce travail ont été obtenues au CNPMAI à l'exception de celle de O. grosii distillé au CFPPA de Nyons.
Les huiles essentielles ont été obtenues par hydrodistillation de la matière végétale sèche ; la teneur en huile essentielle (exprimée en ml/100g de matière sèche) a été déterminée à l'aide de l'appareil de la Pharmacopée Européenne (figures 14 et 15).
Figures 14 et 15 : appareils pour la détermination des huiles essentielles dans les drogues végétales
Les rendements en matière sèche sont exprimés en kilogramme/hectare. Ils sont obtenus par extrapolation des masses de matière sèche par pied, multipliées par une estimation du nombre de pieds à l'hectare soit 50 000. Le rendement (exprimé en litre/hectare) a toujours été calculé en fonction de la première année de culture (1999) et n'a pas été évalué la deuxième année du fait de la mortalité, parfois importante, constatée après un hiver rigoureux. Ces rendements seraient intéressants à déterminer dans des zones moins froides, ils seraient très certainement bien supérieurs à ceux obtenus la première année en région Ile-de-France. Cependant, il n'a pas toujours été possible d'exprimer un rendement en raison du nombre très faible de pieds récoltés.
A.P. Carnat B. Pasquier CNPMAI
Chapitre 4 Matériel végétal et techniques utilisées
4.3. - Analyses des huiles essentielles
4.3.1. - Détermination de l’indice de réfraction
L’indice de réfraction a été déterminé à l’aide d’un réfractomètre ABBE. 4.3.2. - Détermination de la densité
La mesure de la densité a été réalisée à l’aide d’un micro-picnomètre et d’une balance de précision.
4.3.3. - Analyse chromatographique en phase gazeuse (CPG)
L'identification des constituants volatils des huiles essentielles a été réalisée au moyen de la CPG couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM) et la détermination quantitative a été effectuée sur un appareil équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (CPG/FID). La quantification des constituants des huiles essentielles est déterminée par la méthode universelle de normalisation interne sans coefficient de réponse.
4.3.3.1. - Chromatographie couplée à la spectrométrie de masse CPG/SM Chromatographe Hewlett-Packard HP6890 couplé à un spectromètre de masse HP5973
conditions opératoires :
- colonne : DB5 : 30 m x 0,25 mm, épaisseur de film 0,25µm - gaz vecteur : Hélium : 1ml/min
- énergie d’ionisation : 70 eV
- température de l’injecteur : 280°C - température de détecteur : 280°C
- programmation du four 50°C pendant 5 min, 5°C/min de 50 à 300°C, 5 min à 300°C - injecteur mode split 1/10
L'identification des composés a été réalisée par comparaison de leurs spectres de masse et de leurs KI avec ceux des bases de données Adams [73] , NIST [74] , Mc. Lafferty [75] , Jennings [76] , Joulain [77] et celle établie par notre laboratoire. Tous les composés identifiés sont consignés en annexe dans le tableau 108 pages 188 à 194. Les composés marqués d’un astérisque* n’ont été identifiés que par comparaison des spectres de masse sans confirmation par leur indice de rétention.
4.3.3.2. - Chromatographie CPG/FID
conditions opératoires :
- colonne : DB5 : 30 m x 0,25 mm, épaisseur de film 0,25µm - gaz vecteur : Hélium : 1ml/min
- température de l’injecteur : 280°C - température de détecteur : 280°C
- programmation du four 50°C pendant 5 min, 5°C/min de 50 à 300°C, 5 min à 300°C - injecteur mode split 1/20
Le schéma 21 résume le procédé d'identification et de quantification des composés d'une huile essentielle.
plante séchée
huile essentielle
chromatographie phase gazeuse
détecteur FID détecteurmasse
quantification en % identification composition de l'huile essentielle comparaison des spectres de masse
avec les banques de données hydrodistillation
Schéma 21 : synoptique de l'obtention et de l'analyse d'une huile essentielle
La quantification a été acquise par le calcul des aires relatives obtenues par rapport à l'aire totale du chromatogramme à l'aide du logiciel Chemstation de Agilent Instrument. Nous
Chapitre 4 Matériel végétal et techniques utilisées avons admis que les coefficients de réponse sont égaux à 1 pour l'ensemble des composés. Le pourcentage (m/m) de chaque composé sera exprimé par rapport à l'ensemble des constituants.
Nous avons ensuite, à partir des résultats analytiques, lorsque le nombre d'individus est suffisant, réalisé une étude statistique à l'aide du logiciel Systat-10.
Nous utiliserons :
- l'analyse par groupe hiérarchique ou dendrogramme, il résume graphiquement les similitudes et les relations des individus entre eux
- l'analyse en composantes principales (ACP) qui a pour but de comprendre et de visualiser comment les effets de phénomènes à priori isolés se combinent. Elle permet de mieux expliquer la dispersion du nuage de points disponibles,, elle permet ainsi d'informer sur l'axe le plus significatif. La somme des pourcentages des facteurs des 3 axes renseigne sur le taux de déperdition d'information à partir des données de base. Ainsi, si le premier facteur résume 78 %, le second 12 % et le troisième 2 %, l'information représentée sur la figure représente 92 %, l'information "perdue" est donc de 8 %.
Ces analyses auront pour objectif de déterminer des groupes et éventuellement de reconnaître des chémotypes.
Les pourcentages des vingt composés majoritaires de chacun des échantillons étudiés sont présentés en annexe et seront utilisés pour les calculs statistiques.
Les résultats ainsi obtenus (dendrogramme et ACP) seront corrélés par des tests statistiques comparatifs : les plus utilisés sont le X2 et Student. Le premier compare l’homogénéité des résultats de l’expérience avec ceux de la théorie, quand elle existe, le second compare chaque groupe identifié en analysant les moyennes et les écarts-types d’un ou plusieurs composés et permet de confirmer leur possible similitude. Nous avons donc choisi le test de Student, puisqu’il est plus approprié à l’analyse de nos résultats.
L’ensemble des données devrait ainsi permettre ou non de montrer la similitude de composition des huiles essentielles de plusieurs populations, et ce, en fonction de leur origine géographique et/ou de leur année de culture et de récolte.
Pour chaque groupe et/ou pour chaque chémotype, nous avons choisi d’étudier et de discuter la composition de l’huile essentielle pour laquelle le plus grand nombre de composés a été identifié.
Un tableau de la composition détaillée de l'échantillon représentant chaque groupe et/ou chaque chémotype est donné en annexe ainsi que le chromatogramme correspondant.
Pour chaque espèce, une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature sera faite, afin de déterminer une éventuelle similitude de composition. Ces résultats permettront de confirmer ou d'infirmer une relation provenance-composition.
Pour chaque espèce, groupe ou chémotype, la composition de chacune des huiles essentielles sera visualisée par un graphique représentant les composés principaux et pour une meilleure compréhension, ils seront identifiés par une même couleur tout au long du manuscrit (tableau 3).
carvacrol 1,8-cinéole
thymol germacrène-D
para-cymène cis-hydrate de sabinène
γ-terpinène limonène
linalol oxyde de caryophyllène
para-menth-èn-8-ol sabinène
α-terpinéol terpinèn-4-ol
β-caryophyllène trans-hydrate de sabinène
myrcène bornéol
Tableau 3 : couleurs adoptées pour les principaux composés
Les différentes familles de composés représentées graphiquement, seront elles aussi identifiées par une même couleur (tableau 4).
phénols hydrocarbures monoterpéniques
monoterpènes oxygénés hydrocarbures sesquiterpéniques
sesquiterpènes oxygénés autres