)
Chapitre)3:)Matériel)et)Méthodes.)
!
I.� Matériel)végétal)et)ressources)génomiques.)
!
i)� Matériel)biologique):)
!
Les! travaux! de! cette! thèse! portent! essentiellement! sur! cinq! espèces! de! Spartines!:! les!
deux!parents!hexaploïdes!S.#maritima!(2n=6x=60),!S.#alterniflora!(2n=6x=62),!leurs!hybrides!
F1!S.# x# townsendii! (2n=6x=62)! et!S.# x# neyrautii! (2n=6x=62)! et! l’espèce! allododécaploïde!S.#
anglica! (2n=12x=120,! 122,! 124)! issue! du! doublement! du! génome! de!S.# x# townsendii.! Les!
échantillons!de!S.#alterniflora!ont!été!collectés!à!Landerneau!(Finistère,!France).!S.#maritima!
a!été collecté sur les sites de la!Presqu’île du Verdon (Morbihan, France) et!de Noirmoutier!
(Vendée,! France).!S.# x# townsendii! a! été! échantillonné! à! Hythe! (Hampshire,! Angleterre).! Les!
échantillons!de!S.#x#neyrautii!ont!été!collectés!à!Hendaye!(Pyrénées!Atlantiques,!France)!et!S.#
anglica!a!été!prélevée!à!Roscoff!et!dans!l’Anse!de!Goulven!(Finistère,!France;!Tableau!2).!Les!
plantes!entières!ont!été!prélevées!sur!les!différents!sites!avec!une!motte!de!sol!autour!des!
racines!;!puis!transplantées dans!la!serre!expérimentale!de!l’Université!de!Rennes!1!(Rennes,!
France)!et!maintenues!dans!les!mêmes!conditions.!Les!plantes,!transplantées!dans!des!pots!
de! 3! à! 7! litres! (1/3! sable,! 1/3! terre! et! de! 1/3! terreau)! sont! arrosées! quotidiennement!
(environ!6!minutes!le!matin)!à!l’aide!d’un!arrosage!automatique.!Le!cycle!d’éclairage!est!lié!à!
la! photopériode! naturelle.! Les! feuilles! et! racines! ont! ensuite! été! récoltées! et! stockées! à!!
\80°C! jusqu’à! l’extraction! d’ARN! (Ferreira! de! Carvalho! et! al.! 2012).! Plusieurs! espèces! de!
Spartines! (représentant! les! différents! niveaux! de! ploïdie)! ont! également! été! utilisées! dans!
des!analyses!de!données!génomiques!et!dans!le!cadre!d’un!projet!de!séquençage!ciblé!qui!
permettra!d’augmenter!la!profondeur!de!séquençage!de!plusieurs!gènes!d’intérêt!(présenté!
en! Partie! 9! de! ce! chapitre!;! Tableau! 2).!Sporobolus# heterolepis,! une! espèce! proche! de! la!
lignée!des!Spartines!a!également!été!utilisée!comme!outgroup!dans!le!cadre!de!la!capture!de!
séquence.!
Chapitre)3)
94)
Tableau)2:)Liste)des)espèces)(et)leur)provenance))utilisées)pour)les)différentes)analyses.)*):)d’après)(Fortune)et)al.)2007;)
Ainouche)et)al.)2008;)Ainouche)et)al.)2012).)
Espèce!: Niveaux!de!
ploïdie*!:!
Provenance!des!
échantillons:! Analyses!effectuées!:!
S.#alterniflora# 6x! Finistère!(France)!
\!Analyses!transcriptomiques!
\!Analyses!génomiques!
\!Capture!de!séquence!
Morbihan!(France)!
\!Analyses!transcriptomiques!
\!Analyses!génomiques!
\!Capture!de!séquence
S.#maritima# 6x!
Vendée!(France)!
!\! Analyses! transcriptomiques!
(pyroséquençage! de! banques!
normalisées)!
S.#x#townsendii# 6x! Kent!(Angleterre)! \!Analyses!transcriptomiques!
\!Capture!de!séquence!
S.#x#neyrautii# 6x! Pyrénées\Atlantiques!
(France)!
\!Analyses!transcriptomiques!
\!Capture!de!séquence!
S.#anglica# 12x! Finistère!(France)! \!Analyses!transcriptomiques!
\!Capture!de!séquence!
S.#bakeri# 4x! Floride!(USA)! \!Analyses!génomiques!
\!Capture!de!séquence!
S.#gracilis# 4x! Bishop!(CA,!USA)! \!Capture!de!séquence!
S.#pectinata# 4x! Variété!commercialisée!
(var.!aureomarginata)!! \!Capture!de!séquence!
S.#spartinae#(S.#
argentinensis)# 4x!
Santa!Fe!(Argentine!;!
réf.!3072!T.!Colombus)! \!Capture!de!séquence!
Asturies!(Espagne)! \!Capture!de!séquence!
S.#versicolor# 4x!
Var!(France)! \!Analyses!génomiques!
S.#foliosa# 6x! San!Diego!(CA,!USA)! \!Capture!de!séquence!
S.#densiflora# 7x! Andalousie!(Espagne)! \!Capture!de!séquence!
!
95)
ii)� Ressources)génomiques):)
!
Nous!disposons!de!données!génomiques!issues!des!technologies!Roche\454!(Ferreira!de!
Carvalho!2013)!et!Illumina!pour!l’espèce!hexaploïde!Spartina#maritima.!L’ADN!génomique!de!
S.# maritima (collectée! à! la! Presqu’île! du! Verdon! dans! le! Morbihan,! France)! a! été!
pyroséquencé! (un! run! GS! FLX! Roche! 454! technologie! Titanium,! 999! 229! reads! obtenus! ;!
longueur! moyenne! de! 277! bp)! à! la! Plateforme! de! Génomique! Environnementale! et!
Fonctionnelle! du! réseau! Biogenouest! (OSUR,! Rennes).! Les! données! de! séquençage! par!
synthèse! (Illumina! Hi\Seq)! ont! été! obtenues! à! partir! de! banques! d’ADN! génomique! de!S.#
maritima! (collectée! à! la! Presqu’île! du! Verdon! dans! le! Morbihan,! France)! séquencées! au!
Beijing! Genomics! Institute! (BGI!;! République! populaire! de! Chine).! Nous! disposons! de! 3!
librairies!pairées!de!500!pb!;!800!bp!et!2!Kb!(mate\paired!library)!;!le!séquençage!sur!Hi\Seq!
2000! (Illumina)! a! permis! d’obtenir! respectivement! 735,07! ;! 566,82! et! 298,82! millions! de!
séquences! («! reads! »).! L’ADN! génomique! de! S.# alterniflora,! S.# bakeri! et!S.# versicolor!
(synonyme! de!S.# patens)! a! également! été! séquencé! par! Illumina! Hi\Seq! (une! piste! ou!
«!lane!»! par! espèce,! librairies! pairées! à! 500! bp),! permettant! l’obtention! respectivement! de!
177,!162!et!167!millions!de!séquences.!
!
iii)�Ressources)transcriptomiques):)
!
L’ARN! a! été! extrait! chez! les! 5! espèces! de! Spartines! étudiées! (les! deux! parents!
hexaploïdes!S.#maritima!et!S.#alterniflora,!les!deux!hybrides!S.#x#townsendii!et!S#x#neyrautii!et!
l’espèce! allopolyploïde!S.# anglica)! selon! le! protocole! adapté! pour! les! Spartines! (Chelaifa,!
Monnier,! and! Ainouche! 2010;! Chelaifa,! Mahé,! and! Ainouche! 2010).! Des! plants! de! chaque!
espèce!ont!été!maintenus!en!conditions!contrôlées!à!la!serre!de!l’Université!de!Rennes!1!et!
d’autres!ont!été!échantillonnés!sur!différents!sites!selon!un!gradient!d’immersion!qui!va!du!
bas!vers!le!haut!de!l’estran!afin!de!maximiser!les!conditions!d’expression!du!transcriptome!
en!conditions!naturelles.!Les!extractions!d’ARNs!ont!été!réalisées!sur!deux!organes!(feuilles!
et! racines)! comme! cela! a! été! décrit! dans! l’étude! de! Ferreira! de! Carvalho! et! ses!
collaborateurs!(2012).!
Chapitre)3)
Les!banques!d’ADNc!non\normalisées!de!chaque!espèce!ont!été!séquencées!à!l’aide!de!
la! technologie! Roche\454! au! Genoscope! \! Centre! National! de! Séquençage! (Evry,! France)! et!
les! banques! normalisées! pour! l’espèce! S.# maritima! à! la! Plateforme! de! Génomique!
Environnementale! et! Fonctionnelle! du! réseau! Biogenouest! (OSUR,! Rennes,! France).! Le!
séquençage! des! jeux! de! données! Illumina! a! été! effectué! au! Genoscope! (Evry,! France).! Le!
nombre!de!reads!obtenus!pour!chaque!espèce!est!indiqué!dans!le!Tableau!3.!
Tableau)3:)Nombre)de)reads)disponibles)pour)les)différents)jeux)de)données)(RocheQ454)et)Illumina))des)cinq)espèces)du)
genre)Spartina)étudiées.)
Espèces!:! Nombre!de!reads!454!:!
(Longueur!moyenne!=!277!bp)!
Nombre!de!reads!Illumina!:!
(Longueur!moyenne!:!108!bp)!
S.#maritima# 984!006! 76!985!267!
S.#alterniflora# 495!749! 77!321!929!
S.#x#townsendii# 322!773! 71!358!554!
S.#x#neyrautii# 367!577! 65!483!843!
S.#anglica# 314!645! 60!284!800!
!
iv)�Ressources)bioinformatiques)et)logiciels)utilisés):)
!
Les!différents!outils!appliqués!sur!l’ensemble!des!jeux!de!données!des!espèces!du!genre!
Spartina!nécessitent!un!puissant!cluster!de!calcul!et!d’importantes!ressources!de!stockage.!
Pour! répondre! à! cette! demande,! la! plate\forme! bio\informatique! GenOuest! (INRIA\IRISA!
Rennes! Bretagne\Atlantique,! Université! de! Rennes! 1,! France)! du! réseau! Biogenouest!
(http://www.genouest.org/),! a! été! sollicitée! :! elle! met! à! disposition! une! grappe! de!
calculateurs! composée! de! machines! possédant! de! 32G! à! 512G! de! RAM! (Random! Access!
Memory).! Un! gestionnaire! de! travaux! Sun! Grid! Engine! (SGE)! est! utilisé! dans! le! but!
d’optimiser! la! répartition! des! calculs! sur! les! différents! nœuds.! SGE! est! un! programme!
d'équilibrage! de! charge! qui! alloue! d'une! manière! optimale! les! ressources! demandées!
(processeur,! mémoire,! espace! disque)! pour! l'exécution! d'une! tâche! non! interactive.! Pour!
permettre!l’intégration!des!logiciels!sous!Galaxy,!les!différents!programmes!développés!ont!
été! vérifiés! et! validés! à! l’aide! de! machines! virtuelles! spécifiquement! créées! sous!
OpenNebula! 4.8.0.! Ces! machines! sont! hébergées! sur! le! Genocloud! (plateforme! spécifique!
dédiée! à!la! création! et!l’hébergement! de! machines! virtuelles)!de! la! plate\forme!GenOuest.!
Les! différents! résultats! obtenus! au! cours! de! ces! travaux! sont! stockés! sur! le! serveur! de!
l’équipe!Mécanismes!à!l’Origine!de!la!Biodiversité!(MOB!;!serveur!interne!au!laboratoire)!qui!
dispose!d’une!capacité!de!stockage!de!30!To!(5X6!To!;!Serial!ATA!7!200tr/min!;!RAID!5).!
Les! différents!programmes! développés!au! cours!de! cette! thèse!ont! été!réalisés! à! l’aide!
du!langage! python!(v.2.7)!et!du!langage! Bash!(Bourne\Again!shell).!Différents! logiciels!sont!
utilisés!pour!permettre!la!visualisation!des!données!et!le!traitement!des!résultats!obtenus.!
La! visualisation! des! données! est! rendue! possible! grâce! à! l’utilisation! des! logiciels! Tablet!
(Milne!et!al.!2009)!(v.!1.12.03.26)!et!Jalview!(Waterhouse!et!al.!2009)!(v.!2.7).!Tablet!est!un!
logiciel! permettant! de! lire! différents! formats! de! fichiers! (.ace,! .sam,! .bam),! et! de! visualiser!
les!résultats!d’assemblage!de!taille!importante!issues!de!données!de!type!NGS!(les!différents!
contigs avec leurs reads associés). Le logiciel Jalview, qui permet!de visualiser et!d’éditer des
fichiers! fasta! de! petite! taille! contenant! plusieurs! séquences,! est! utilisé! dans! les! étapes! de!
vérification! de! construction! d’haplotypes.! L’analyse! des! résultats! est! effectuée! grâce! au!
langage! de! programmation! et! l’environnement! R! (v.! 2.13.0! ;! http://www.r\project.org/;! R!
Development!Core!Team!2011).!Les!différentes!analyses!phylogénomiques!ont!été!réalisées!
à!l’aide!des!logiciels!MEGA!(v.5.2.1!;!Tamura!et!al.!2011),!Geneious!(v.6.1.6!;!Drummond!et!
al.!2010),!et!RAxML!(v!7.2.8!;!Stamatakis!2014).!Les!arbres!obtenus!à!partir!du!logiciel!RAxML!
ont!été!visualisés!à!l’aide!du!logiciel!Dendroscope!v3.2.2!(Huson!and!Scornavacca!2012).!
Dans le document
Identification et évolution des séquences orthologues par séquençage massif chez les polyploïdes
(Page 94-98)