Matériel et méthodes

ANIMAUX 

Les animaux étaient issus de 5 génotypes différents dont une lignée Castor® sélectionnée par la  production  de  fourrure  et  élevée  au  centre  INRA  du  Magneraud  (Surgères,  France),  trois  lignées  mâles (AGP38, AGP39 et AGP79) et une lignée femelle (croisement AGP77 et AGP59) fournies par le 

Jour 1  Jour 2  Jour 3 Jour 6 

Insemination artificielle + 1,6 µg  d’acétate de buséréline (i.m.)  Collecte des  embryons  65 à 72 h post IA  Injections deux fois par jour (s.c.) de pFSH (+/‐ 20% pLH) à 12h d’intervalle  4,5 µg ^{9 µg  9 µg} 4,5 µg  4,5 µg sélectionneur Grimaud Frères Sélection SAS (Roussay, France). Pour chaque lignée, les lapines étaient  logées  individuellement  dans  les  mêmes  conditions  avec  l’eau  et  l’aliment  fournis  ad  libitum.  Les  lapines  ont  été  réparties  de  façon  homogène  dans  trois  groupes  expérimentaux  en  prenant  en  compte le génotype et la parité de chaque femelle : 

‐ « T » Groupe témoin comprenant des lapines non superovulées (n=93). 

‐ « pFSH  +  pLH »  Groupe  de  lapines  superovulées  avec  une  préparation  commerciale  (Stimufol®, Reprobiol, Belgique) contenant de la pFSH et de la pLH (ratio pLH/pFSH ~ 20 %)  isolée d’hypophyses porcines (n=80). 

‐ « pFSH »  Groupe  de  lapines  superovulées  avec  une  préparation  de  gonadotropines  rafinée  contenant  uniquement  de  la  pFSH  (ratio  pLH/pFSH  ~0  %)  isolée  d’hypophyses  porcines  (n=81). 

Tous  les  traitements  ont  été  administrés  à  des  femelles  en  repos  sexuel,  au  moins  deux  semaines après le sevrage. 

TRAITEMENTS HORMONAUX 

Les  préparations  hormonales  proviennent  de  la  Faculté  de  Médecine  Vétérinaire  de  Liège  (Belgique)  et  étaient  présentées  en  flacons  contenant  les  hormones  sous  forme  de  lyophylisat.  Chaque flacon contenait 500 µg de pFSH (lot 04I24) avec ou sans 20 % (w/w) de pLH. Juste avant de  réaliser  les  injections,  les  hormones  ont  été  dissoutes  dans  56  ml  de  sérum  physiologique  pour  obtenir  une  concentration  finale  en  pFSH  de  9  µg/ml.  Les  préparations  hormonales  de  superovulation  des  groupes  « pFSH+pLH »  et  « pFSH »  ont  été  administrées  en  5  injections  successives (i.m.) réparties sur cinq demi‐journées représentant une dose totale de 31,5 µg de pFSH  par femelle (figure 9).   Figure 9. Protocole de superovulation des femelles donneuses d’embryons                 

Dix  à  douze  heures  après  la  dernière  injection  de  gonadotropines,  les  femelles  ont  été  inséminées  avec  0,5  ml  d’un  mélange  polyspermique  et  l’ovulation  était  induite  immédiatement  après par injection (i.m.) de 0,4 ml de Receptal® (Intervet, France) représentant 1,6 µg d’acétate de  buséréline (analogue de synthèse de GnRH) par femelle. Les femelles du groupe témoin n’ont reçu  aucun  traitement  de  superovulation  préalable  et  ont  été  inséminées  au  même  moment  que  les  lapines des autres groupes. 

COLLECTE DES EMBRYONS 

Les  embryons  de  tous  les  groupes  ont  été  collectés  après  euthanasie  des  femelles  donneuses, 65 à 72 heures après l’induction d’ovulation. A ce moment, les embryons sont au stade  morula  (32  cellules)  à  morula  compactée.  Les  tractus  génitaux  (oviductes  et  cornes  utérines)  sont  alors immédiatement prélevés et perfusés de manière normograde avec 20 ml de liquide de collecte  (Euroflush®,  IMV  Technologies,  France) ;  les  embryons  sont  alors  collectés  dans  une  boite  de  pétri.  Les structures ovariennes sont observées et le nombre de follicules préovulatoires (diamètre > 1mm),  de  follicules  hémorragiques  (diamètre  >1mm  avec  présence  de  sang)  et  de  corps  jaunes  sont  enregistrés (photo 5).  Photo 5. Structures ovariennes d’une lapine superovulée ayant ovulée                   

Les  embryons  et  les  ovocytes  collectés  sont  ensuite  dénombrés  et  observés  sous  loupe  binoculaire  (x10)  pour  évaluer  leur  qualité  selon  les  critères  morphologiques  établis  par  l’IETS  (International  Embryo  Transfer  Society).  L’évaluation  de  l’intégrité  de  la  zone  pellucide  et  du  manteau  muqueux  et  de  l’homogénéité  des  blastomères  permet  de  distinguer  les  embryons  de  bonne qualité (qualités 1 à 2 notées Q1 & Q2) et ceux de mauvaise qualité (qualité 3 notée Q3). Les  embryons sont stockés à température ambiante et dans l’obscurité avant congélation pendant une  durée n’excédant pas 2h. Pour chaque groupe expérimental, le pourcentage de femelles donneuses  Corps jaunes  Follicules  hémorragiques  Follicules  préovulatoires

d’embryons (pourcentage de femelles ayant donné au moins un embryon de bonne qualité), le taux  de  collecte  (nombre  total  collecté  /  nombre  de  corps  jaunes)  et  le  taux  de  viabilité  embryonnaire  (nombre d’embryons de bonne qualité / nombre total collecté) ont été déterminés. 

CONGELATION ET DECONGELATION DES EMBRYONS 

Seuls  les  embryons  de  bonne  qualité  ont  été  conservés  et  plus  de  3000  embryons  ont  été  congelés  selon  le  protocole  décrit  par  Joly  et  al.  (1998).  Brièvement,  les  embryons  sont  exposés  successivement pendant 5 minutes à trois bains contenant respectivement 0,5 ; 1 et 1,5M de DMSO  (réf. D2650, Sigma‐Aldrich, France) dans une solution d’« IMV holding medium » (IMV Technologies,  France). Placés dans le dernier bain, les embryons sont alors montés en paillettes stériles de 0,25 ml  (IMV Technologies, France) scellées par un bouchon stérile permettant l’identification (figure 10).  Figure 10. Schématisation du montage des embryons en paillettes avant congélation             

Après  5  minutes  dans  le  dernier  bain,  les  paillettes  sont  placées  dans  un  congélateur  programmable  (Cryocell  1200,  IMV  Technologies,  France)  préalablement  équilibré  à  ‐7°C.  Après  5 minutes  d’équilibration,  le  « seeding »  (induction  de  la  cristallisation)  est  réalisé  en  touchant  l’extrémité  de  la  paillette  située  à  côté  du  bouchon  avec  des  pinces  refroidies  dans  l’azote  liquide  jusqu’à l’apparition des premiers cristaux de glace (opacification du milieu). Une deuxième période  d’équilibration  de  5  minutes  est  observée  avant  de  refroidir  les  paillettes  jusqu’à  ‐30°C  avec  une  vitesse  de  0,5°C/min,  puis  elles  sont  directement  plongées  dans  l’azote  liquide  pour  un  stockage  d’une durée minimum de 48 h. 

Les  paillettes  d’embryons  stockées  dans  l’azote  liquide  sont  décongelées  en  les  plaçant  à  température ambiante pendant 10 à 15 secondes avant immersion dans un bain‐marie à 20°C jusqu’à  fonte  complète  des  cristaux  de  glace  (environ  1  minute).  Après  réchauffement,  les  embryons  sont  incubés pendant 5 minutes à température ambiante dans chaque bain contenant des concentrations  décroissantes en cryoprotecteurs. Cette étape est nécessaire pour le retrait du DMSO et réhydrater  les  embryons.  Les  embryons  sont  donc  placés  successivement  dans  l’« IMV  holding  medium »  contenant 1 ; 0,5 puis 0M de DMSO.   Bouchons de coton Alcool polyvinylique Bouchon stérile  Bulles d’air Milieu de congélation avec ou  sans embryons (   ) 

CULTURE IN VITRO DES EMBRYONS DECONGELES 

Au  total,  349  embryons  ont  été  décongelés  pour  évaluer  leur  viabilité  in  vitro  dont  117  embryons du lot « pFSH+pLH », 128 embryons du lot « pFSH » et 104 embryons du lot « T ». Après  décongélation  et  retrait  du  cryoprotecteur,  les  embryons  ont  été  cultivés  dans  un  milieu  TCM199  (Sigma‐Aldrich, France) supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (Sigma‐Aldrich, France)  dans  une  atmosphère  humide  à  38°C  et  5  %  CO2.  La  capacité  de  développement  in  vitro  des  embryons  décongelés  est  évaluée  par  le  taux  de  développement  des  morulas  jusqu’au  stade  blastocyste/blastocyste épanoui après 24 et 48 h de CIV. 

TRANSFERT DES EMBRYONS DECONGELES 

Trois cent quatorze embryons ont été transférés dans 28 femelles receveuses PS19 (Grimaud  Frères  Sélection  SAS)  dont  96  embryons  « pFSH+pLH »,  107  embryons  « pFSH »  et  111  embryons  « T ».  L’ovulation  de  ces  femelles  est  induite  par  injection  (i.m.)  de  1,6  µg  d’acétate  de  buséréline  correspondant  à  0,4  ml  de  Receptal®  (Intervet,  France)  50  à  60  h  avant  la  réalisation  du  transfert  conférant  un  léger  asynchronisme  (~12h)  de  ces  femelles  par  rapport  aux  lapines  donneuses.  Les  receveuses ont été anesthésiées à l’aide d’une injection (i.m.) de kétamine (5mg/kg, Imalgène 1000®,  Biomérieux,  France)  et  de  médétomidine  (80µg/kg,  Domitor®,  Orion  Pharma,  Finland)  10  minutes  avant la chirurgie. Après décongélation, les embryons sont rapidement montés dans un capilaire de  transfert en verre de 50 µl avec un minimum de milieu « IMV holding medium » (~10 µl) connecté à  une  seringue  de  1  ml.  En  moyenne,  11,2  embryons  ont  été  transférés  dans  chaque  femelle  receveuse. Les transferts ont été réalisés par laparotomie midventrale au niveau de la ligne blanche  directement  dans  la  lumière  des  cornes  utérines,  juste  en  dessous  de  la  jonction  utéro‐tubaire.  La  capacité de développement in vivo des embryons décongelés a été mesurée par l’évaluation du taux  de  parturition  (nombre  de  femelles  mettant  bas  /  nombre  de  femelles  transférées),  du  total  de  lapereaux nés et le taux de survie embryonnaire (nombre de lapereaux nés vivants & morts / nombre  d’embryons transférés). 

ANALYSE STATISTIQUE 

Les  variables  de  collecte  mesurées  pour  la  production  d’embryons  sont  tout  d’abord  le  pourcentage  de  femelles  donneuses  puis  pour  chaque  femelle  donneuse,  on  a  dénombré :  les  follicules  préovulatoires  (FP),  les  folllicules  hémorragiques  (FH),  les  corps  jaunes  (CJ),  les  ovocytes  (OV),  le  total  des  embryons  collectés  ( TEC ),  les  embryons  de  bonne  qualité  (EBQ)  et  de  mauvaise  qualité  (EMQ).  A  l’exception  du  pourcentage  de  femelles  donneuses,  l’analyse  statistique  a  été 

réalisée  uniquement  à  partir  des  données  obtenues  chez  les  femelles  donneuses  d’embryons.  Les  variables mesurées pour l’évaluation in vitro et in vivo de la viabilité embryonnaire sont les taux de  développement jusqu’au stade blastocyste après culture in vitro et les taux de parturition, de survie  embryonnaire après transfert dans une femelle receveuse. 

Un  test  du  Chi‐deux  avec  la  correction  de  Yates  (SAS/STAT®,  SAS  Institute  Inc.)  a  été  utilisé  pour  comparer  les  effets  des  3  groupes  expérimentaux  sur  le  pourcentage  de  femelles  donneuses  d’embryons  et  les  résultats  des  expériences  d’évaluation  de  la  viabilité  embryonnaire  in  vitro  et  in  vivo. Les effets du traitement de superovulation utilisé, du génotype des lapines traitées et de leur  interaction  sur  les  variables  de  collecte  décrites  ci‐dessus  ont  été  analysés  par  un  modèle  linéaire  général (GLM) à deux effets fixés (SAS/STAT®, SAS Institute Inc.). L’effet de la parité n’est pas inclus  dans  le  modèle  statistique  présenté  car  seules  des  femelles  nullipares  ont  été  utilisées  pour  le  génotype  AGP39.  Néanmoins,  l’effet  de  la  parité  a  été  évalué  en  appliquant  le  modèle  statistique  pour chaque niveau de parité (nullipare, primipare, multipare).