Matériel et méthode

1. Contact avec les centres de la faune sauvage

Le contact avec ces centres a été établi par téléphone afin de savoir s’ils étaient volontaires pour participer à l’étude. Si c’était le cas, des kits d’écouvillonnage accompagnés de fiches de renseignement était envoyés et le personnel soignant formé effectuaient l’écouvillonnage (Annexe 1 et Annexe 2). Les fiches de renseignement individuelles demandaient le lieu de ramassage de l’oiseau, l’espèce, le sexe, l’âge, la raison de l’admission et le devenir de l’oiseau s’il était connu.

2. Population cible

Les échantillons sont prélevés uniquement sur des rapaces, étant définis comme des oiseaux de proie pourvus d’un bec fort et crochu et de serres puissantes. Ce terme vernaculaire regroupe en réalité plusieurs ordres d’oiseaux.

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3. Collecte des échantillons

Lors de l’examen clinique d’admission, les bénévoles des centres ont écouvillonné le choane et le cloaque des oiseaux. Le protocole de prélèvement a été approuvé par le Comité d’Ethique sur l’utilisation et le soin aux animaux de l’Université de l’Oregon (« Oregon State University Animal Care and Use Committee »).

L’écouvillonnage a été réalisé en utilisant des écouvillons floqués et des tubes Eppendorfs® secs. Les kits d’écouvillonnage envoyés aux centres contenaient 2 écouvillons, 2 tubes Eppendorfs® et une fiche à remplir concernant l’oiseau échantillonné (Annexe 1). Le tout était emballé dans un sachet stérile.

Figure 8 : Kit d’écouvillonage

4. Extraction d’ADN

Après échantillonnage, les écouvillons sont gardés au congélateur à une température de -18°C jusqu’au moment de l’analyse. L’ADN est extrait des écouvillons en utilisant le « DNeasy Blood and Tissue kit » (Qiagen #69506) selon les recommandations du fournisseur en ajoutant 5mM de Dithiothreitol (DTT) au tampon de lyse. L’ADN extrait est conservée dans 50µL de solution tampon (Buffer AE) et conservé à – 18°C.

Les poux ont été prélevés sur 14 rapaces dans un centre de faune sauvage de l’Oregon. L’extraction d’ADN a été réalisée en utilisant les mêmes kits et protocoles que précédemment. L’ADN obtenu a été quantifié et sa pureté analysée par spectrophotométrie à 260nm et 280nm (Nanodrop®) puis conservé à -18°C.

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5. Identifications bactériennes

5.1. Choix des amorces

Une PCR ciblant l’extrémité 5’ de la séquence 16s de l’ADN ribosomale du genre

Chlamydia a été utilisée pour évaluer la présence de Chlamydiacea (Tableau 8). Deux paires

d’amorces différentes ciblant les Chlamydiaceae ont été utilisée : l’une pour identifier la présence de Chlamydiaceae dans les échantillons, et l’autre pour confirmer les échantillons positifs.

Tableau 8 : Séquences des amorces spécifiques aux Chlamydiales ciblant les séquence16s et 18s de l’ADN ribosomique présents dans les échantillons choanaux et cloacaux de rapaces. La position de la séquence homologue sur le gène 16s est indiquée en partant

du point +1 de transcription.

Une recherche dans le logiciel BLAST montre que les amorces choisies présentent une correspondance de 100% avec les souches de C. trachomatis, C. psittaci, C. avium, C.

pecorum et C. muridarum. Les séquences des amorces ont été comparées à différents

génomes de Chlamydia spp. en utilisant le logiciel Geneious software package® et la séquence 16s cible est conservée dans tous les génomes analysé.

Une paire d’amorces 18s (Tableau 8) a été utilisée pour amplifier la séquence 18s de l’ADN ribosomique de poux. Cet ADN a été utilisé comme témoin positif lors de la recherche d’ADN de poux dans les échantillons choanaux d’oiseaux avec la même amorce 18s.

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Programme permettant de trouver des régions similaires entre plusieurs séquences de nucléotides (BLASTN) ou d’acides aminés (BLASTP). BLAST permet de trouver rapidement dans une base de données des séquences similaires, et calcule la signification statistique des correspondances trouvées.

Nom Séquence(5’→3’) Position (bp) Référence

Chlam16sF GTGGATGAGGCATGCRAGTCGA 44-65 (Ossewaarde and Meijer, 1999)

Chlam16sR CTCTCAATCCGCCTAGACGTC 295-315

16sIGF CGGCGTGGATGAGGCAT 40-56 (Everett et al., 1999a)

16sIGR TCAGTCCCAGTGTTGGC 321-337

18S2F CCTGGTTGATCCTGCCAGTA 3-22 Cette étude

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5.2. Déroulement de la PCR

Les mélanges PCR ont eu la même composition tout au long de l’étude, quels que soient les amorces ou les échantillons. Le mélange est composé de 10µL de master mix commercial (New England Bio Labs™, Phusion™ High-Fidelity Master Mix with HF Buffer), de 6µL d’eau stérile exempte de nucléase, 2µL d’ADN et 1µL de chacune des amorces (à 5 pM). Les cycles PCR sont composés d’une phase initiale de dénaturation à 98°C pendant 1 minute, une phase de dénaturation à 94°C pendant 10 secondes, une phase d’hybridation à 55°C pendant 15 secondes et d’une phase d’élongation à 72°C pendant 30 secondes. Un cycle est réalisé 25 à 35 fois. La phase d’élongation finale est réalisée à 72°C pendant 5 minutes.

Après amplification, les produits sont analysés par électrophorèse sur un gel d’agarose 1%. Pour chaque série de PCR, de l’eau stérile et exempte de nucléase est utilisée comme témoin négatif, et une souche laboratoire de Chlamydia caviae ou Chlamydia

abortus sont utilisées comme témoin positif.

5.3. Test de la séquence choisie

Des souches de C. abortus, C. trachomatis et C. caviae du laboratoire ont été utilisées afin d’évaluer la performance de la détection par PCR. Les amorces ont aussi été testées sur différentes bactéries : E. coli et gram + provenant d’un échantillon de la cavité buccale d’un oiseau.

La sensibilité de la PCR a été évaluée par 4 dilutions successives au dixième sur une souche de laboratoire de C. caviae.

5.4. Identification précise de l’espèce

Les produits PCR 16s des échantillons positifs pour Chlamydia spp.ont été séquencés selon la méthode Sanger. Les produits de PCR permettant le séquençage ont été extraits grâce à un kit de purification d’ADN (Thermoscientific™, Purelink™ Quick Gel Extraction kit).

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La méthode est nommée d’après le Pr. Frederick Sanger, double prix Nobel de chimie. L’ADN cible est intégrée dans un plasmide bactérien. Après réplication de la bactérie et lyse de sa membrane, les plasmides contenant l’ADN cible sont isolés. L’ADN double brin du plasmide est dénaturé par chauffage. La réplication de l’ADN cible, assurée par l’ADN polymérase et par la présence de désoxynucléotides (dNTP), s’arrête lors de l’ajout d’un nucléotide modifié (didésoxynucléotide, ddNTP). Les différentes séquences obtenues subissent une électrophorèse sur gel, permettant aux séquences plus courtes de migrer plus loin dans le maillage d’agarose. Les différentes séquences obtenues sont lues dans l’ordre

55 croissant de taille, et la lecture du nucléotide terminal modifié de chaque séquence permet d’obtenir la séquence de l’ADN cible.