Article 3. L’inhibition de la fucosylation des composés pariétaux par traitement au 2-fluoro 2-désoxy
1. Matériel biologique et conditions de culture
1. Matériel végétal
Les graines d’Arabidopsis thaliana utilisées pour ces travaux sont, sauf indication, d’écotype Columbia (Col-0). Les graines mutées par l’insertion d’un ADN-T dans leur génome ou par méthode chimique, sont issues du centre NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre) et proviennent des collections SALK (SALK Institute Genomic Analysis Laboratory, SIGnAL, Etats-Unis) et SAIL (Syngenta Arabidopsis Insertion Library). Pour le gène SIA2, deux lignées mutantes ont été sélectionnées : le mutant SALK_059690, nommé sia2-1 et le mutant SAIL-259-H07, nommé qrt1xsia2-2. Pour le mutant mur2 (At2g03220), qui est un mutant chimique, les graines ont été obtenues du centre NASC (N8565).
Les graines du mutant quartet ont été fournies par Mark Johnson (Brown university), le mutant cgl par CT Anderson (Pennsylvania State university), et les graines pCYCB1::GUS proviennent d’Alan Marchant (Southampton university).
Des graines de tomate cerise (Solanum lycopersicum var. cerasiforme WVA 106), fournies par Pierre Baldet (laboratoire de Biologie du Fruit et Pathologie,UMR 1332,INRA Bordeaux), et des graines de tabac (Nicotiana benthamiana) ont également été utilisées lors de ces études.
Une partie des expériences a été menée sur des suspensions cellulaires de tabac Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow -2 (BY-2).
2. Culture in vitro
Arabidopsis : Sous hotte, des graines sont placées dans un tube Eppendorf et immergées 5 min dans une solution d’éthanol à 50%. Puis, l’éthanol est remplacé par une solution d’hypochlorite de sodium à 30% (v/v) pendant 2 min. Les graines sont rincées ensuite six fois avec de l’eau distillée stérile. Deux milieux de culture sont utilisés pour la culture in vitro d’Arabidopsis, selon l’expérience envisagée. Le milieu Arabidopsis (Duchefa Biochemie) est préparé à raison de 11,82 g.L-1 en présence de 2 mM de Ca(NO3)2. Le pH du milieu est ajusté à 5,8 par du KOH. Le milieu de culture de Murashige and Skoog (MS, Duchefa-Biochemie) est utilisé au demi (2,2 g.L-1) et son pH est ajusté à 5,6 par ajout de KOH. 0,8% (p/v) de Vitro Agar (Kalys) sont ajoutés au milieu avant stérilisation à l’autoclave (120 °C, 20 min, 1 bar). Du
saccharose, 1% (p/v) est ajouté au milieu MS après stérilisation. Dans le cas des tests de l’effet d’analogues de sucres sur la croissance des plantes, les molécules sont ajoutées au milieu de culture, à la concentration désirée, avant d’être coulé dans des boîtes de Pétri.
Les graines sont semées sur milieu de culture puis les boîtes de Pétri sont placées 48 h à 4°C pour stratifier les graines. Elles sont ensuite placées verticalement en chambre de culture maintenue à 21°C, avec une photopériode 16 h jour (120 µE.m-2.s-1) /8 h nuit.
Tomate et tabac: Les graines de tomate cerise et de tabac sont stérilisées de façon similaire aux graines d’Arabidopsis puis semées exclusivement sur milieu MS supplémenté avec 1% de saccharose.
BY-2 : Les suspensions cellulaires de BY-2 sont cultivées dans un milieu BY-2 liquide constitué de milieu MS à 4,3 g.L-1 ; 3% (p/v) saccharose ; 100 mg.L-1 KH2PO4 ; 51 mg.L-1 myo-inositol ; 1 mg.L-1 thiamine et 0,22 mg.L-1 acide 2,4 dichlorophénoxyacétique. Le pH du milieu est ajusté à 5,6-5,8 avec une solution molaire de KOH puis stérilisé. Chaque semaine, 10 mL de suspension sont repiquées dans 150 mL de milieu BY-2 frais, en conditions aseptiques. Les cultures sont placées à l’obscurité, à 24°C sous agitation permanente (140 rpm).
3. Culture en terre
La culture des plantes s’effectue par semis des graines sur de la terre stérile (autoclavée pendant 30 min à 120°C, 1 bar) contenue dans des bacs. Les cultures ont lieu dans des phytotrons respectant une photopériode de 16 h jour/8 h nuit. La température y est de 20°C en période de jour et de 16°C lors de la période de nuit pour la culture d’Arabidopsis et de 25°C et 22°C pour la tomate et le tabac. L’hygrométrie est maintenue à 60% et les plantes sont arrosées tous les deux jours.
4. Culture in vitro du pollen en milieu liquide
Arabidopsis : 40 fleurs d’Arabidopsis ouvertes le jour-même sont récoltées et placées dans 1 mL de milieu de germination (5 mM CaCl2 ; 0,01% H3BO3 ; 1 mM MgSO4 ; 5 mM KCl ; 10% (p/v) saccharose ; pH 7,5). Le tube est agitée et vortexé pendant 5 min de manière à libérer le pollen des anthères. La densité de pollen relâché est vérifiée au microscope inversé, puis tous les résidus floraux sont retirés à l’aide d’une paire de pinces fines. La culture est centrifugée
pendant 7 min à 3 200 g. Un culot jaune, correspondant aux grains de pollen, est visible. Le surnageant est éliminé et 250 µL de milieu de germination sont ajoutés pour resuspendre le pollen. Le tube est ensuite placé horizontalement dans une étuve à 22°C pendant 6 h, à l’obscurité, sans agitation. Ce protocole de culture in vitro spécifique au pollen d’Arabidopsis a été optimisé par Boavida & McCormick (2007).
Tomate et tabac: Une fleur, récoltée au stade anthèse et débarrassée des pétales et sépales, est placée dans un pilulier de verre avec 1 mL de milieu de germination BK (Brewbaker et Kwack, 1963) constitué de 1,62 mM H3BO3 ; 1,27 mM Ca(NO3)2 4H2O ; 2,97 mM KNO3 et 0,87 mM MgSO4 7H2O contenant 10% (p/v) de saccharose. Le pilulier est agité pour libérer le pollen des anthères, puis la fleur est retirée du milieu. Après 6 h de culture à température ambiante sous agitation de 5 oscillations/min et à l’obscurité, le taux de germination est vérifié au microscope.
Les tubes polliniques utilisés dans le but d’une étude par immunomarquage sont fixés avec un volume de solution de fixation (100 mM PIPES buffer pH 6,9 ; 4 mM MgSO4 7H2O ; 4 mM EGTA ; 10% (p/v) saccharose ; 4% (v/v) paraformaldéhyde). Tandis que les tubes polliniques utilisés pour des analyses de biochimie sont fixées par ajout de 3 volumes d’éthanol absolu. Après fixation, les cultures sont stockées à 4°C.
5. Souches bactériennes et agrobactéries
Des souches d’Escherichia coli compétentes DH5α (subcloning efficiencyTM, Invitrogen), c'est-à-dire capables d’incorporer un ADN étranger et de le multiplier, ont été utilisées pour amplifier le plasmide pBI101.3 (fourni par l’Arabidopsis Biological Resource Center) contenant l’ADNc du gène At3g48820 (U19220, fourni par l’Arabidopsis Biological Resource Center) sous le contrôle du promoteur pollen-spécifique PPE50 (promoteur du gène At5g07410, Louvet et al., 2006).
La complémentation des plantes qrt1xsia2-2+/- a été obtenue par transformation via Agrobacterium tumefaciens. La souche d’agrobactérie qui a été utilisée est EHA105 contenant le plasmide pEHA105 (Hood et al., 1993), résistante à l’antibiotique rifampycine. Elle se multiplie à 28°C dans un bouillon de culture lysogène (LB, 10 g.L-1 de tryptone ; 5 g.L-1 d'extrait de levure ; 10 g.L-1 de NaCl ).
6. Milieu de culture des bactéries
Préculture : Une colonie bactérienne est placée dans 5 mL de milieu LB supplémenté avec le(s) antibiotique(s) de sélection (à une concentration finale de 25-50 µg.mL-1) et incubée 8 h à 37°C sous agitation (300 rpm).
Culture en milieu liquide : 100 µL de préculture sont ajoutés à 100 mL de milieu LB (plus les antibiotiques de sélection). La culture est placée à 37°C durant une nuit, sous agitation (300 rpm).
Culture en milieu solide : les bactéries sont étalées en boîte de Pétri sur un milieu LB solide (milieu LB additionné de 10 g.L-1 agar bactériologique) contenant l’ (les) antibiotique(s) de sélection.
Stockage : 500 µ L d’une préculture bactérienne sont conservées dans du glycérol 50% stérile (v/v) puis placées à -80°C.