MASTOCYTOSE : RESULTATS

Le travail sur la mastocytose présenté dans ce manuscrit fait suite à une partie des travaux de thèse soutenue en 2011 par le docteur S. Georgin Lavialle dont voici les résultats :

(1) In vivo, à partir de biopsies cutanées congelées de lésions de mastocytoses, il existe une différence significative d’expression en RT-Q-PCR de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) entre les enfants et les adultes (enfants n=48 et adultes n=60, p=0,033). Cette expression est normalisée par rapport à l’expression de c-Kit.

(2) En fonction du type de mutation de KIT retrouvée chez les enfants (n=46), il existe une différence significative d’expression de hTERT entre le groupe avec mutation de l’exon 8 ou de l’exon 9 (n=17), et le groupe avec mutation de l’exon 17 (n 17) (p=0,03).

(3) L’activité de la télomérase mesurée par QTRAP dans les mastocytes triés et les précurseurs hématopoïétiques issus de moelle osseuse est augmentée chez les patients atteints de mastocytose avec mutation D816V de KIT (n=4) par rapport au groupe contrôle (n=4) (test statistique non significatif).

Ces résultats suggèrent fortement un rôle potentiel des télomères et de la télomérase dans l’évolution de la mastocytose de l’adulte et dans la régression de la mastocytose chez l’enfant et ce en fonction du type de mutation de KIT.

Le travail de thèse présenté dans le chapitre « résultats I » fait suite à ces travaux. Nous avons dans un premier temps complété les travaux in vivo comparant l’expression de hTERT en immunohistochimie entre les adultes et les enfants atteints de mastocytose, et avons confirmé la différence d’expression de hTERT entre enfants et adultes. L’étude de la longueur des télomères chez les enfants a été effectuée en formant deux groupes de patients en fonction des mutations de KIT : non-PTD (exons 8 et 9) et PTD (exon 17). En immuno-FISH, les télomères sont plus longs dans les mastocytes des biopsies cutanées d’enfants ayant une mutation PTD de KIT.

Afin d’approfondir ces résultats in vitro, nous avons suggéré que les mutations activatrices de KIT, localisées sur des exons différents, seraient responsables d’une variation d’expression de la télomérase et de la longueur des télomères. Dans un premier temps, nous avons étudié un modèle murin de mastocytes médullaires comportant un récepteur c-Kit muté sur le domaine PTD ou non-PTD et avons détecté des télomères plus courts dans les mutants non-PTD associés à une sénescence plus élevée. Ensuite, nous avons testé un modèle de fibroblastes primaires humains. Les résultats obtenus sont similaires au modèle de mastocytes primaires murins. Cependant, nous n’avons pu mettre en évidence de différence d’expression ou d’activité de la télomérase, nulles dans ces modèles humains.

La régulation de la longueur des télomères est dépendante (1) de l’activité du complexe de la télomérase, (2) de l’intégrité du complexe protéique « shelterin » associé aux télomères, (3) de l’intervention d’un mécanisme alternatif d’allongement des télomères par recombinaison.

En l’absence de résultat positif sur l’expression et l’activité de la télomérase dans ce modèle, nous avons émis l’hypothèse que les différents mutants de KIT pouvaient réguler l’expression ou intervenir sur la régulation post-transcriptionnelle des protéines du complexe « shelterin » ; et notamment TRF2 qui lie l’ADN télomérique. Les résultats préliminaires montrent que l’expression en ARN de TRF2 est supérieure au contrôle dans les mutants PTD et non-PTD, mais l’expression protéique en immunofluorescence est plus faible et diffuse dans le mutant non-PTD. Le mutant PTD et le contrôle ont des signaux de fluorescence punctiformes similaires.

Dans une seconde partie du travail intégrée au chapitre « résultats I », nous avons étudié un cas de sarcome mastocytaire récemment publié (Georgin-Lavialle et al., 2013) associé à une mutation non- PTD de KIT. En effet, ces mutations sont associées aux mastocytoses de l’enfant, et dans près de 80% des cas publiés, les lésions cutanées ont tendance à régresser, soit partiellement le plus souvent, soit totalement dans près de 20% des cas. Ainsi, l’évolution vers une pathologie agressive de type sarcome ou leucémie est paradoxale mais représente environ 3% des cas de mastocytose pédiatrique. Nous avons émis l’hypothèse d’une réexpression de la télomérase expliquant la « transformation » en sarcome. Les résultats montrent : (1) les cellules sarcomateuses c-Kit positives n’expriment pas la télomérase, (2) la longueur des télomères est hétérogène dans ces cellules (S. Georgin-Lavialle), (3) il existe une importante instabilité génétique en aCGH, (4) la colocalisation en immunofluorescence de PML et TRF2 suggère la présence d’APBs et de mécanisme d’ALT, associés à l’expression de p53 et Ki67.

En parallèle, étant donné l’hétérogénéité des données d’évolution de la mastocytose chez l’enfant, C. Méni a procédé à une importante revue de la littérature regroupant près de 1500 cas de mastocytose pédiatrique publiés depuis 1950 afin de déterminer avec précision l’évolution et les caractéristiques de régression de la maladie chez l’enfant. Ces résultats font l’objet d’un article rédigé en anglais et non soumis au moment de la rédaction, retrouvé dans le chapitre « résultats II ».

Brièvement : (1) le sexe ratio est de 1/1, (2) près de 70% des cas sont des atteintes cutanées de type urticaire pigmentaire, (3) près de 80% des enfants suivis présentent une symptomatologie régressive dont près de 20% totalement régressive, (4) la durée de suivi est hétérogène et courte (7 ans en médiane) et la plupart des cas débutent avant l’âge de 2 ans, (5) dans près de 3% des cas rapportés il existe une évolution de la pathologie vers un sarcome ou une leucémie à mastocytes, d’évolution fatale, (6) seulement 10% des mastocytoses rapportées (n=151) ont été génotypées et la proportion de

En conclusion, dans cette première partie de résultats (I et II), nous montrons que les mastocytoses de l’enfant, régressives dans l’ensemble, sont associées à des télomères courts et à un phénotype de sénescence in vitro. Contrairement aux mastocytoses de l’adulte associées à des télomères plus longs et à une activation de la télomérase in vivo sans pour autant le démontrer in vitro. Par ailleurs, l’activation constitutive de c-Kit dans le modèle in vitro de mutant non-PTD semble interagir avec la régulation d’expression de TRF2, protéine « shelterin » indispensable à la physiologie du télomère.

RESULTATS I

IN MASTOCYTOSIS, TELOMERE SHORTENING CORRELATES WITH KIT MUTATIONS: A NEW