IV- A NNEXE 4 : C OMPOSITION DU MILIEU DEPOLARISANT UTILISE LORS DES
3- Marquage tissulaire
i. Le cœur de souris
Une fois le cœur prélevé, il est canulé et rétro-perfusé avec une solution de Tyrode (Annexe 1) héparinée à 4°C pour le vider du sang résiduel. Il est ensuite fixé dans un tampon phosphate (Annexe 3) supplémenté de 4% de paraformaldéhyde (PAF) durant 4 heures à température ambiante. Un marquage nécessite la réalisation de coupes de tissus d’une épaisseur de 20 μm. Pour cela, une congélation du muscle cardiaque est effectuée dans de l’isopentane à -80°C. Il est indispensable qu’un protocole de cryoprotection soit appliqué au cœur pour conserver son intégrité tissulaire durant la congélation. Ainsi, après deux rinçages au PBS à 4°C, le cœur est incubé dans une succession de bains de saccharose d’1 heure, d’abord à 5% puis à 10% à température ambiante et enfin dans une solution à 25% toute la nuit à 4°C.
ii. Les muscles squelettiques de la patte de souris
Une fois que la souris a été sacrifiée par dislocation cervicale et nettoyée au savon antibactérien, tous les muscles squelettiques des pattes postérieurs sont prélevés et placés dans une solution de PBS (Annexe 3) maintenue à 4°C. Ils sont ensuite fixés dans un tampon phosphate (Annexe 3) supplémenté de 3% de PAF durant 4 heures à température ambiante. Une immunohistochimie nécessite, comme pour le cœur, la réalisation de coupes de tissus d’une épaisseur de 20 μm. Pour cela, une congélation du muscle squelettique est effectuée dans de l’isopentane à -80°C après qu’un protocole de cryoprotection ait été appliqué. Ainsi, après deux rinçages au PBS à 4°C, les muscles sont incubés dans une succession de bains de saccharose d’1 heure, d’abord à 5% puis à 10% à température ambiante et enfin dans une solution à 25% toute la nuit à 4°C.
b. Coupes tissulaires
Pour réaliser des coupes de tissus d’une épaisseur de 20 μm, le cœur et les muscles squelettiques sont tout d’abord plongés dans une solution d’isopentane à -80°C durant 20 secondes pour être congelés. Puis ils sont enduits de tissu Tek pour faciliter la réalisation des
109 coupes au moyen d’un cryostat (Leica CM 3050). Les tranches de tissus sont alors déposées sur des lames, mises à sécher durant 24 heures à température ambiante et placées à -20°C pour être conservées.
c. Marquage au trichrome de Masson
Le kit de marquage au trichrome de Masson (Sigma) est composé de différents réactifs permettant de visualiser en microscopie à transmission le collagène et les cellules musculaires au niveau tissulaire.
Les coupes de cœur, d’une épaisseur de 20 μm et déposées sur une lame de verre, sont sorties du congélateur et réhydratées avec de l’eau désionisée. Elles sont ensuite incubées 5 minutes dans une solution de biebrich scarlet et d’acide fuchsine pour marquer d’une couleur rosée le tissu musculaire. Après avoir été rincées de nouveau avec de l’eau désionisée, elles sont placées durant 5 minutes dans un bain d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique qui sont des fixateurs de colorants. Les coupes sont alors disposées 5 minutes dans une solution d’aniline marquant en bleu le collagène, et rincées 2 minutes avec une solution d’acide acétique diluée à 1% puis avec de l’eau désionisée. Enfin elles sont déshydratées avec de l’alcool 70° puis conservées à 4°C.
d. Immunohistochimie des muscles squelettiques
i. Principe
Cette technique est similaire à l’immunocytochimie, excepté que la détection et la visualisation d’une structure sont réalisées au niveau tissulaire. Le marquage est également indirect et il nécessite l’utilisation d’anticorps primaires qui vont se lier spécifiquement à la cible, et d’anticorps secondaires couplés à un fluorochrome qui sont dirigés contre les anticorps primaires (Figure MM-20). La préparation est ensuite observée au microscope à fluorescence permettant ainsi une localisation de l’élément marqué.
ii. Protocole
Le marquage est réalisé sur les coupes tissulaires obtenues par le cryostat. Elles sont tout d’abord réhydratées dans du PBS 1X, pendant dix minutes à 4°C puis saturées dans du PBS- BSA 1%, pendant 20 minutes à température ambiante. Pour comprendre la répartition cytoplasmique des noyaux provenant de fibres musculaires squelettiques contrôles et mdx, les coupes de tissus ont été incubées durant 2 heures à l’obscurité avec du TOPRO-3 dilué au
110 1/1000ème dans du PBS-BSA 4% Triton X-100 0,5% à température ambiante et en chambre humide. Puis, elles sont montées sur des lamelles de verre au Mowiol et mises à sécher 24 heures avant d’être conservées à 4°C ou d’être visualisées à une longueur d’onde de 655 nm.
VI- Méthodes statistiques
Comme les données obtenues proviennent de deux populations (contrôles et mdx) indépendantes et non appariées, l’outil mathématique choisi pour déterminer la significativité statistique des différences entre nos échantillons a été le test de Student (t test). L’égalité des variances entre les deux échantillons, évaluée par le test de Fisher-Snedecor (F-test), est la condition insdispensable pour appliquer ce t test. Lorsque cette exigence n’est pas remplie, un test de Mann-Withney a été appliqué.
Les résultats sont présentés selon leur moyenne ± SEM. ns : non significatif : * P ≤ 0,05 et >0,01
** : P ≤ 0,01 et > 0,001 *** : P ≤ 0,001
R
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Résultats
I- Avant-propos
La partie « Résultats » de ce manuscrit expose les données expérimentales obtenues pendant le travail de thèse. Des résultats préliminaires, qui n’ont pas été soumis pour publication, sont tout d’abord décrits car ils ont été obtenus lors du dévéloppement de la technique de microscopie de conductance ionique à balayage (SICM) au cours de la première année de doctorat. Puis, les résultats concernant la dystrophie musculaire de Duchenne sont présentés au travers d’un article scientifique, rédigé en anglais et présenté sous la forme où il a été soumis pour publication dans le journal Cardiovascular Research (1er auteur). Cette partie « Résultats » s’organise donc en deux sections.
La première section décrit un ensemble de résultats préliminaires obtenus par SICM. Cette partie révèle des organisations surfaciques variées, montrant les possibilités d’application de cette technique à de nombreux types cellulaires, ainsi que les perspectives de recherche qui peuvent y être associées.
La deuxième section présente les résultats soumis à publication. Elle expose les altérations des systèmes membranaires, surfaciques et tubulaires, dans les cardiomyocytes ventriculaires provenant de souris mdx âgées de 10 à 12 mois (modèle d’étude de la dystrophie musculaire de Duchenne). Puis elle présente les conséquences fonctionnelles de ces perturbations au niveau de l’activité cellulaire des myocytes d’abord au repos, puis lors de stimulations mettant en jeu le couplage excitation-contraction (CEC). Enfin, la localisation et la distribution des différents acteurs du CEC sont présentées et analysées pour corréler les anomalies structurales et fonctionnelles observées dans les cardiomyocytes mdx.
Ce travail présente donc un double aspect : un aspect technique par la mise en place du SICM dans notre équipe de Physiologie et Pharmacologie des Canaux Ioniques. Effectivement, cette étape indispensable a nécessité la réalisation d’un stage d’un mois au sein du laboratoire londonien « National Heart and Lung Institute » sous la direction des Drs Julia Gorelik et Yuri Korchev ainsi que de leurs équipes respectives. Ce travail est aussi une
112 étude physiologique sur les structures membranaires et leurs fonctions dans les
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