La marche de la maladie

O cloridrato de prometazina ((RS)-N,N-dimethyl-1-(10H-phenothiazine-10- yl)propan-2-amine hydrochloride) é um derivado das fenotiazinas (Figura 11) e apresenta ação antagônica dos receptores H1 de primeira geração, exibindo propriedades anti- histamínica, antiemética e sedativa (YANAI, 2012). Desde sua introdução no mercado em 1946, sua aplicação vem sendo destinada ao tratamento de náuseas, vômitos, enxaqueca e alergias, podendo ser aplicado como sedativo ou sonífero (TARKKILA et al., 1995; CANTISANI et al., 2013). O cloridrato de prometazina pode ser administrado por via intramuscular, intravenosa, tópica, retal e via oral, com ótima absorção pelo trato gastrointestinal. Seu metabolismo ocorre no processo de primeira passagem pelo fígado, dando origem ao sulfóxido de prometazina e, em menor quantidade a desmetilprometazina. O composto é amplamente distribuído nos tecidos, com alta taxa de ligação a proteínas (80 a 90%) e tempo de meia vida entre 12 a 15 horas, apresentando capacidade de atravessar a placenta e barreira hematoencefálica. Sua eliminação ocorre após o processo de segunda passagem pelo fígado, passando pelo rim e sendo eliminado na urina. (CANTISANI et al., 2013).

Fonte: CANTISANI et al., 2013. Figura 11. Fórmula estrutura do cloridrato de prometazina.

A atividade anti-histamínica da prometazina ocorre por meio de antagonismo competitivo, evitando a ação da histamina e bloqueando sua ligação aos receptores H1 presentes na membrana celular. É importante ressaltar que esse efeito não ocorre inibindo a secreção de histamina, mas impedindo sua ação direta. Os receptores H1 também estão presentes no cérebro (BrH1R) e a capacidade da prometazina em atravessar a barreira hematoencefálica também proporciona o bloqueio desses receptores, levando a sonolência, fadiga, perda do apetite e diminuição das funções cognitivas (dificuldade de memória e aprendizagem). Seu efeito antiemético pode estar relacionado a propriedade anticolinérgica, bloqueando os receptores muscarínicos e impedindo a ação da acetilcolina em estimular as células parietais gástricas, cessando o estimulo para o vômito e a sensação de náusea (CANTISANI et al., 2013).

Dados na literatura demonstram o efeito antimicrobiano da prometazina, tendo efeito inibitório para Burkholderia pseudomallei, Candida albicans e Candida tropicalis (CASTELO-BRANCO et al., 2013; SIDRIM, et al., 2016; BRILHANTE et al., 2017). Essa atividade se deve ao efeito inibitório na bomba de efluxo, importante fator de virulência presente nos microrganismos que ocasionam maior tolerância aos fármacos (KOLACZKOWSKI; MICHALAK; MOTOHASHI, 2003). A prometazina também foi capaz de ocasionar perda a função mitocondrial e dano a integralidade da membrana celular fúngica. Ademais, também foi constatado sua atividade inibitória nos biofilmes de Burkholderia pseudomallei e Candida tropicalis (SIDRIM, et al., 2016; BRILHANTE et al., 2017). Todavia, novos estudos são necessários para elucidarem os mecanismos envolvidos na sua atividade e melhor avaliar seu efeito antifúngico. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da prometazina sobre os biofilmes de FSSC. De modo que a PMZ tem um papel como inibidor no crescimento planctônico, nos biofilmes fúngicos e na atividade de bomba de efluxo.

3. HIPÓTESES

1. A PMZ apresenta ação inibitória frente ao crescimento planctônico de FSSC; 2. A PMZ possui ação sinérgica em combinação com AMB e VRZ frente as células

planctônicas de FSSC;

3. A PMZ inibe todas as etapas de formação do biofilme de FSSC; 4. A PMZ é capaz de inibir a atividade de bomba de efluxo de FSSC.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GERAL

Investigar o efeito da PMZ, um inibidor de bomba de efluxo, nas células planctônicas e nos biofilmes de Espécies do Complexo Fusarium solani (FSSC).

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Avaliar a sensibilidade das células planctônicas e dos biofilmes de FSSC frente a PMZ;

2. Investigar o efeito sinérgico, in vitro, da PMZ em combinações com AMB e VRZ frente as células planctônicas de FSSC;

3. Avaliar o efeito da PMZ sobre a adesão, desenvolvimento e maturação de biofilmes de FSSC;

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1 LOCAL DE ESTUDO

O estudo foi conduzido no Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), pertencente ao Departamento de Patologia e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará (UFC).

5.2 MICRORGANISMOS UTILIZADOS

Foram utilizadas 10 cepas de FSSC isoladas de pacientes com infecções oculares

(Tabela 1). As cepas estão disponíveis na coleção de cultura do Centro Especializado em

Micologia Médica da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil. A identificação molecular dos isolados foi baseada na metodologia descrita por Alastruey-izquierdo et al. (2008), com adaptações. As cepas foram cultivadas sob agitação (100 rpm) em YEPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 2% de glicose) por 72 horas a 35 ºC. O DNA genômico foi isolado usando o kit de extração (Higth Pure PCR Template Preparation, Roche Amplied Science, EUA) e armazenadas a -20 ºC para posterior amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Para reação de PCR foram aplicados os primers EF1 (50-TGGGTAAGGARGACAAGAC) e EF2 (50-GGARGTACCAGTSATCATGTT) (BORGES et al., 2018). As amplificações pela PCR foram realizadas em um volume final de 25 µl, contendo: 5 µl de tampão, 2,6 µl de cloreto de magnésio (MgCl2), 5,5 µl de água ultrapura, 2,5 µl para cada primer, 5 µl de dNTP, 0,05 µl de Taq polimerase e 2 µl de DNA extraído. As condições utilizadas na amplificação pela PCR foram de 95 ºC por 2 minutos, 40 ciclos, 95 ºC por 30 segundos, 54 ºC por 30 segundos, 72 ºC por 40 segundos, seguidos de uma extensão final de 72 ºC por 4 minutos. A cada reação de amplificação foram incluídos um controle positivo formado por F. solani, previamente identificado, e um controle negativo (água ultrapura).

Os fragmentos amplificados foram analisados em eletroforese de cuba horizontal, 10 µl de cada amostra contendo 1 µl de Blue Green foram dispostas em gel de agarose a 2%, previamente imerso em tampão TBE (0,045M Tris-Borato; 1mM EDTA). A corrida eletroforética foi realizada por 1 hora e a visualização das bandas foram realizadas sob transiluminação com luz ultravioleta. Os fragmentos amplificados foram enviados para

sequenciamento (ACTgene, RS, BRA). As sequências de DNA foram montadas e comparadas com espécies do gênero Fusarium utilizando o banco de dados do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) de acordo com Alastruey-Izquierdo et al. (2018).

Tabela 1. Identificação e origem das cepas utilizadas nesse estudo.

Cepas Espécies Origem

5776 Fusarium falciforme Ùlcera de córnea

5464 Fusarium falciforme Ceratite

5372 Complexo de Espécies Fusarium solani (FSSC)

Ceratite

5673 Fusarium keratoplasticum Ceratite

954 Fusarium keratoplasticum Ùlcera de córnea

831 Fusarium keratoplasticum Ùlcera de córnea

1436 Fusarium keratoplasticum Ùlcera de córnea

984 Fusarium keratoplasticum Ùlcera de córnea

1033 Fusarium keratoplasticum Ùlcera de córnea

933 Fusarium keratoplasticum Ùlcera de córnea

CEMM 03-6-072 Candida tropicalis Lavado

broncoalveolar

ATCC 22019 Candida parapsilosis Humana

Nota: ATCC: American Type Culture Collection.

5.3 ETAPAS EXPERIMENTAIS

Este trabalho foi organizado em duas etapas. A etapa inicial constituiu na avaliação de sensibilidade das células em forma planctônica e interação da prometazina (PMZ) em combinações com voriconazol (VRZ) e anfotericina B (AMB), assim como o efeito da PMZ sobre bombas de efluxo aplicando a metodologia por rodamina 6G. Na segunda etapa, foi analisada a sensibilidade dos biofilmes de FSSC frente a PMZ. As análises dos biofilmes ocorreram nos períodos de adesão celular com 90 minutos, desenvolvimento do biofilme com 48 horas e no biofilme maduro após 48 horas de formação, sendo avaliada a atividade metabólica por redução do XTT, biomassa por coloração com cristal violeta e morfologia por meio da microscopia confocal. As etapas experimentais foram conduzidas conforme descrito na Figura 12.

Figura 12. Organograma e etapas experimentais deste estudo. Os números entre parênteses representam a quantidade de cepas utilizadas em cada experimento. FSSC: Complexo de Espécies Fusarium solani. Confocal: Microscopia Confocal de Varredura a Laser. MEV: Microscopia Eletronica de Varredura.

FSSC (n=10) Sensibilidade a PMZ 1º ETAPA Células planctônicas (n=10)

Interação com ATF

(n=2) Bomba de Efluxo em células planctônicas (N=2) Rodamina 6G 2ª ETAPA Células em biofilme Atividade metabólica (n=6)

Biomassa (n=6) Análise estrutural (n=1)

1ª PARTE EXPERIMENTAL