Mutações pré-core (G1896A) e BCP (A1762T/G1764A) no vírus da hepatite B em pacientes de Alagoas, Brasil)
Alba M.X. Eloy1,2; Marcílio L. Figueiredo3; Regina C. Moreira3; Jéfferson L.A. Silva4, Maria
R.C.D. Coêlho4,5
1 Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde (ICBS) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) 2 Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes (UFAL) 3 Setor de Hepatites Virais do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo (IAL-SP)
4.Setor de Virologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE)
5 Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Endereço correspondência para Alba Maria Xavier Eloy: Rua Barão José Miguel nº 249/601 Farol ,Maceió-AL CEP 57055-160
Tel. 82 99684084
e-mail: [email protected]
RESUMO
A mutação da região pré-core, G1896A é detectada com maior freqüência nos genótipos B,C,D,E e F, enquanto que, as mutações na região basal do promotor core (BCP) A1762T e G1764A são descritas em todos os genótipos. O objetivo do estudo foi investigar os genótipos e as mutações pré-core e BCP em pacientes HBsAg e anti-HBc positivos, acompanhados pela carga viral, perfil HBeAg/anti-HBe e nível de alanina aminotransferase (ALT). Foram analisados 17 portadores assintomáticos e 16 pacientes com hepatite B crônica. Os genótipos identificados foram: A (84,4%), C (9,4%), D (3,1%) e F (3,1%). No genótipo A, a mutação pré-core foi detectada em 3,8% (1/26) e as BCP em 52,4% (11/21). No genótipo C foi identificada apenas a mutação BCP em 33,3% (1/3) e não foram identificadas mutações nos genótipos D e F. O estudo identificou pela primeira vez a presença destas mutações no genótipo A no Estado de Alagoas, Brasil. As mutações BCP foram detectadas equitativamente nos portadores assintomáticos e com hepatite crônica, independentemente da carga viral e nível sérico de ALT. Os resultados da pesquisa
contribuíram para ampliar as informações envolvendo o genótipo A, servindo de referência para novas investigações.
Palavras chaves: Mutação pré-core, Mutação no promotor core, vírus da hepatite B.
INTRODUÇÃO
A variação genética do HBV é devida em parte, à falta de um mecanismo de revisão envolvendo as atividades da DNA polimerase durante o processo de transcrição reversa do RNA pré-genômico, favorecendo o aparecimento de mutações pontuais, deleções ou inserções1.
Naturalmente são encontradas variantes das regiões pré-S/S, pré-C/C e P, resultando uma população de vírus com genomas heterogêneos, denominados por quasispecies2.
A transição de G para A no nucleotídeo (nt) 1896 cria um códon de terminação prematuro na região pré-core que previne a síntese do antígeno e do vírus da hepatite B (HBeAg), reduzindo a replicação viral3. Por outro lado, a presença de timina no nt 1858, formando um par de base (A-
T) com a adenina do nt 1896, torna o sinal de encapsidação do RNA pré-genômico mais forte, aumentando a eficiência da replicação, apesar da presença de anti-HBe. Os genótipos B, C, D e E, possuem timina no nt 1858, o F possui citosina ou timina e o A geralmente apresenta citosina. O que justifica a maior freqüência, dessa mutação nos genótipos B, C, D, E e F4.
As mutações na região basal do promotor core (BCP) A1762T e G1764A são descritas independentemente da soroconversão do HBeAg5,6 e são comuns em diferentes genótipos7,8. A
ocorrência dessas mutações isoladas ou acompanhadas da mutação pré-core G1896A, tem sido associada com hepatite B crônica ativa em infecções HBeAg negativo/anti-HBe positivo5.
O objetivo desse estudo foi investigar os genótipos e a presença de mutações pré-core G1896A e BCP A1762T/G1764A em pacientes com infecção crônica pelo HBV, caracterizando-a pela carga viral, perfil HBeAg/anti-HBe e nível sérico da ALT.
PACIENTES E MÉTODOS
Pacientes
Durante o período de setembro de 2006 a outubro de 2007 foram selecionados 33 pacientes (20 homens e 13 mulheres) com sorologia positiva para HBsAg e anti-HBc, provenientes dos centros de referência em hepatites virais do Estado de Alagoas. Foram 17 portadores assintomáticos e 16 pacientes com hepatite B crônica, confirmada histologicamente.
Após o preenchimento de um questionário com os dados demográficos e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, a coleta de sangue foi realizada por meio de punção venosa, sem anticoagulante.
Dosagem de alanina aminotransferase
Foi utilizado kit comercial (Abbott Laboratórios do Brasil) executado de acordo com as instruções do fabricante. Considerou-se como valor normal (N) quando a concentração de ALT foi menor que 1,5 vezes o limite normal superior (LNS, 55U/L) e de elevado (E) quando maior ou igual a 1,5 x LNS 9.
Marcadores sorológicos
Os marcadores HBeAg/anti-HBe (Symbiosis Diagnóstica Ltda São Paulo, Brasil) foram pesquisados por ensaio imunoenzimático (ELISA).
Extração e amplificação parcial do gene S e região pré-core
O DNA viral foi extraído por meio do tratamento do soro com isotiocianato de guanidina- fenol (LGC Biotecnologia), precipitado com etanol absoluto gelado e ressuspendido em 50 µL de água livre de RNASE e DNASE (Ludwig Biotec)7.
A amplificação parcial do gene S e região pré-core foram realizadas segundo protocolo de Sitnik et al.7, utilizando para o gene S, os primers: FHBS1 (5’GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC3’),
RHBS1 (5’AAATKGCAC TAGTAAACT3’) no primeiro ciclo de amplificação (PCR I) e FHBS2 (5’CGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC3’), RHBS2 (5’GCCARGAGAAACGGRCTGAGGCCC3’), para reamplificação. Para a região pré-core foram utilizados os primers descritos por Takahashi et al.10
EP1.1 (5’TCATGGAGACCACCG TGAAG3’) e EP1.2 (5’GGAAAGAAGCAGAGGCAA3’) para o primeiro ciclo e EP2.1 (5’CATAAGAGGCTCTGGACT3’) e EP2.2 (5’GGCAAAAAAGAGAGTAACTC3’) para o segundo ciclo. Em cada tubo de PCR foi adicionado 10 µL de DNA viral extraído mais 90 µL de
uma solução pré-mix (10mM tampão Taq DNA polimerase, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 150µM
dois ciclos de PCR foi realizada nas seguintes condições: 94ºC, 20s, seguido por 30 ciclos de 94ºC, 20s; 56ºC, 20s; 72ºC, 30s e uma etapa final de extensão a 72ºC, 7 min, para o gene S e 94ºC, 30s, seguido por 30 ciclos de 94ºC, 30s; 56ºC, 30s; 72ºC, 40s e uma etapa final de extensão a 72ºC, 5 min, para a região pré-core.
Carga viral - Titulação do DNA HBV
Para estimar a carga viral, amostras de soro, puros e diluídos, foram submetidas ao protocolo de extração do DNA viral com NAOH 0,5M seguido diretamente de PCR da região
core como descrito por Kaneko et al.11, utilizando os
primers1763F(5`GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAA3`),2032R(5`CTGACTACTAATTCCCTGG ATGCTGGGTCT3`), para o primeiro ciclo e 1778-F(5`GACGAATTCCATTGACCCGTATAAAGAATT3`) e 2017R
(5`ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA3`), para o segundo ciclo. Em tubos contendo 10 µL de amostras de soro puros e diluídos (10-2, 10-4, 10-6, 10-8 e 10-10), com água milli Q autoclavada,
foram adicionados 2,5µl de NAOH 0,5M. Após uma hora a 37ºC foram acrescentados 2,5 µL de HCL 0,5M e 85 µL de pré-mix contenco10mM tampão taq polimerase, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 150µM de cada um dos quatro dNTP, 20 pmol/µL de cada primer e 2,5U taq polimerase.
A reação de amplificação foi realizada sob as seguintes condições: 94ºC, 60s; seguido por 30 ciclos de 94ºC, 60s; 45ºC, 60s; 72ºC, 90s e ao final uma etapa de extensão a 72ºC, 7 min.
A carga viral (genomas/mL) foi calculada multiplicando-se o título da reação, correspondendo a mais alta diluição do soro com PCR positiva pelo limite de detecção do método (3 x 102 genomas/mL), como descrito por Anjos12.
Identificação dos fragmentos genômicos
Os fragmentos genômicos amplificados foram visualizados por meio de corridas eletroforéticas em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio a 1%, como corante.
Reação de seqüenciamento
Para o seqüenciamento direto13, os produtos de amplificação foram submetidos a uma
nova amplificação, utilizando os primers FHBS2 e RHBS2, para o gene S e EP2.1 e EP2.2, para a região pré-core e o “DYEnamic EDTye Terminator Cicle Sequencing kit”, adaptado para o seqüenciador automático MegaBace 500® (GE Healthcare).
Análise das seqüências
A análise dos genótipos foi realizada por comparação entre as seqüências obtidas com as seqüências de diferentes genótipos de HBV depositadas no Genbank. A classificação dos genótipos foi confirmada pela ferramenta Genotyping disponível no site do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi). As mutações foram identificadas pelo alinhamento das seqüências de nucleotídeos obtidas no estudo e comparadas com uma seqüência do vírus selvagem. Para estas análises foram utilizados os programas EditSeq e Megalign do pacote DNAstar (Lasergene Inc., Madison, WI, EUA).
RESULTADOS
A tabela 1 mostra as características demográficas, perfil HBeAg/Anti-HBe, nível sérico da ALT, carga viral, genótipos e mutações, em 17 portadores assintomáticos e 16 com hepatite B crônica.
Tabela 1. Dados demográficos e características da infecção pelo vírus da hepatite B em portadores assintomáticos e hepatite crônica. Alagoas-Brasil, Setembro 2006 a Outubro 2007.
Mutação Pacientes (n = 33) Idade (Sexo) ALT (U/L) HBeAg / anti-HBe Carga viral (cópias/mL) Genótipo BCP Pré-core Portador 43 (M) E2 -/+ 3 x 102 F - - assintomático 14 (M) E -/+ 3 x 104 C - - (n = 17) 18 (F) N3 -/+ 3 x 108 C - - 31 (F) N +/- 3 x 1010 D - - 32 (F) N -/+ 3 x 102 A nd - 49 (F) N -/+ ≤ 3 x 102 A nd - 21 (M) N +/- 3 x 104 A nd - 28 (F) N -/- ≤ 3 x 102 A + - 26 (M) N -/+ 3 x 102 A + nd1 31 (F) N -/+ ≤ 3 x 102 A + - 25 (F) E -/+ 3 x 104 A + - 32 (M) N -/+ 3 x 108 A + - 41 (F) N -/+ ≤ 3 x 102 A - - 41 (F) N -/+ 3 x 102 A - - 27 (M) N -/+ 3 x 104 A - nd 31 (M) E -/+ 3 x 104 A - - 32 (M) N -/+ 3 x 108 A - - Hepatite 36 (M) E +/- 3 x 102 A + - Crônica 54 (F) N +/- 3 x 104 A + - (n = 16) 29 (M) N -/+ 3 x 106 A + - 38 (M) E -/+ 3 x 010 A + - 31 (M) N -/+ 3 x 010 A + - 33 (F) N -/+ 3 x 106 A + - 30 (M) E -/+ 3 x 108 A - - 24 (M) E -/+ 3 x 012 A - - 14 (M) N -/+ 3 x 1012 A - + 38 (M) N -/+ ≤ 3 x 102 A - - 32 (M) N -/+ 3 x 102 A - - 30 (M) N -/+ ≤ 3 x 102 C + - 28 (M) E -/+ 3 x 104 A Nd - 46 (M) N +/- 3 x 1010 A Nd - 46 (F) N -/+ ≤ 3 x102 A Nd - 47 (F) N -/+ 3 x 102 nd Nd -
Os genótipos foram investigados em 32 seqüências. Sendo identificado em 84,4% (27/32) o genótipo A, em 9,4% (3/32) o C, em 3,1% (1/32) para ambos os genótipos D e F (Figura 1). A presença de timina na posição 1858 foi identificada em 50% (13/26) das seqüências do genótipo A e em 33,3% (1/3) do genótipo C, sendo ausente nos genótipos D e F.
A mutação pré-core G1896A foi pesquisada em 31 seqüências, sendo identificada em um paciente com hepatite crônica pelo HBV genótipo A, que apresentou carga viral de 3x1012cópias/mL, concentração sérica normal de ALT e HBeAg-negativo e anti-HBe-positivo. As
mutações BCP A1762T e G1764A foram investigadas em 26 seqüências, sendo 21 do genótipo A, três do C, uma do D e uma do F. Foram identificadas em 52,4% (11/21) das infecções pelo genótipo A, 50% (5/10) em portadores assintomáticos e 54,5% (6/11) em pacientes com hepatite crônica. No genótipo C foram detectadas em 33,3% (1/3).
DISCUSSÃO
O polimorfismo nucleotídico que ocorre naturalmente ao longo do curso das infecções pelo HBV é responsável pelo aparecimento de mutações pontuais no genoma viral. As combinações dessas mutações podem ter uma pluralidade de significados clínicos em infecções por diferentes genótipos.
As mutações pré-core G1896A/C1899A e BCP A1762T/G1764A são as mais freqüentes e por isso vêm sendo investigadas intensivamente 4,6,10,13-19. Porém, a maioria destes estudos
envolve pacientes asiáticos com infecções pelos genótipos B e C do HBV 9,20. No Brasil, a
literatura contemplando os genótipos A, D e F, ainda é escassa, sendo este o primeiro trabalho descrevendo mutações em pacientes portadores da infecção pelo HBV em Alagoas, Brasil.
84.4% 3.1% 9.4% 3.1% A (n=27) C (n=3) D (n=1) F (n=1)
O genótipo A geralmente possui citosina (C) na posição 1858 de acordo com os estudos de De Castro et al.21 e Sitnik et al. 7, que encontraram citosina em 100% e 90% dos isolados deste
genótipo, respectivamente. No entanto, em nosso estudo a presença da citosina foi observada em 50% dos isolados. Essa freqüência foi próxima a 68,4%, encontrada por Rezende17.
A circulação do mutante pré-core G1896A do genótipo A é rara e mostra uma relação com a presença de citosina no nt 1858 7,13,17,21. Em nossa pesquisa, também encontramos uma baixa
freqüência dessa mutação, embora a presença de timina tenha sido encontrada em 50% das seqüências do genótipo A investigadas.
A timina forma um par de base com a adenina na posição 1896, tornando o sinal de encapsidação do RNA pré-genômico mais forte, favorecendo a replicação viral13. A presença de
mutação pré-core em um paciente com carga viral alta pode ser justificada pela substituição de citosina por timina no nt 1858, embora não tenha sido possível identificar a referida substituição.
. A freqüência da mutação BCP A1762T/G1764A encontrada no genótipo A, mostra uma
concordância com os achados de Sitnik et al.7, em relação à taxa de positividade de 62% (31/50).
Porém, difere dos resultados encontrados por De Castro et al.21 cuja freqüência foi de 20% (2/10).
Sua distribuição de forma equitativa entre os portadores assintomáticos e com hepatite crônica independentemente do nível sérico de ALT e carga viral, parece não interferir no curso clínico das infecções pelo HBV. No entanto, em estudos com outros genótipos as mutações BCP foram relacionadas com maior atividade e freqüência da hepatite B crônica. Sendo consideradas um dos fatores virais preditores e independentes, de risco para o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular (HCC) 6,18,19, 21.
A identificação da única mutação A1762T/G1764A no genótipo C em paciente de origem não asiática difere do estudo de Sitnik et al.7 que encontraram esta mutação em 76,9% em
pacientes asiáticos. Ressaltando que no Brasil a maioria dos estudos não detectou esse genótipo
17,22-29, sendo detectado apenas por Bottecchia et al.30 e Oliveira et al.31.
O estudo identificou pela primeira vez em Alagoas/Brasil a presença das mutações pré- core G1896A e BCP A1762T/G1764A no genótipo A em infecções pelo HBV. A freqüência de citosina na posição 1858 não apresentou relação com a baixa freqüência da mutação pré-core no genótipo A. As mutações BCP foram detectadas equitativamente nos portadores assintomáticos e com hepatite crônica, a despeito da carga viral e nível sérico de ALT. Os resultados da pesquisa contribuíram para ampliar as informações envolvendo o genótipo A, servindo de referência para novas investigações.
Contribuição dos autores
(1) Contribuiu substancialmente para a concepção e planejamento, (2) Contribuí na análise e interpretação dos dados (3) Contribuí significativamente na elaboração do rascunho ou na revisão crítica do conteúdo; e (4) Participei da aprovação da versão final do manuscrito.
(1) Alba M.X. Eloy, Regina C. Moreira, Maria R.C.D. Coêlho.
(2) Alba M.X. Eloy, Regina C. Moreira, Marcílo L. Figueiredo, Maria R.C.D. Coêlho.
(3) Alba M.X. Eloy, Regina C. Moreira, Marcílo L. Figueiredo, Jéfferson L.A. Silva, Maria R.C.D. Coêlho.
(4) Alba M.X. Eloy, Regina C. Moreira, Marcílo L. Figueiredo, Jéfferson L.A. Silva, Maria R.C.D. Coêlho.
Agradecimentos
Laboratório de Biotecnologia do Centro de Ciências Agrárias/Universidade Federal de Alagoas, Setor de Biologia Molecular do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami da Universidade Federal de Pernambuco, Laboratório de Hepatites Virais do Instituto Adolfo Lutz.
Financiamento
FAPEAL por meio da concessão de uma bolsa de doutorado.
Conflito de interesses
Os autores declaram não haver interesses pessoais, comerciais, políticos, acadêmicos ou econômicos relacionados ao conteúdo deste artigo científico.
Aprovação ética
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em pesquisa da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) segundo protocolo de pesquisa n 000906/2005-98.
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