Méthodologie

a. L’extraction aqueuse

Un échantillon de 20 g de chaque plante sélectionnée a été séché puis broyés en poudre. Ensuite, chaque plante sèche en poudre a été mise en infusion, décoction, percolation et à macération dans de l'eau distillée.

(i) La décoction (d) est obtenue en faisant bouillir la poudre dans de l'eau pendant 5 à 10 minutes.

(ii) La macération (m) résulte de mettre la poudre dans de l'eau froide pendant 24 heures.

(iii) La percolation (p) La percolation consiste à envoyer de la vapeur d'eau de haut en bas, à travers la plante en poudre ce qui permet d’obtenir une extraction améliorée. Elle est plus rapide et elle est surtout employée pour les feuilles et les fleurs.

(vi) L’infusion est une solution résultante de l'action dissolvante de l'eau bouillante sur la plante. Celle-ci est plongée dans l'eau bouillante pendant 15 à 20 minutes suivant la plante. Le récipient doit être couvert afin de ne pas libérer les principes actifs.

Ensuite, l'extrait a été filtré en utilisant du papier mousseline ou de papier Whatman n°1. Le filtrat été séché à 40°C pendant toute une nuit. La poudre d'extrait final a été collectée et stockée dans un endroit frais et sec. La poudre obtenue a été utilisée pour préparer des solutions à des concentrations de 50 mg/ml dans de l'eau distillée.

b. Détermination de la zone d’inhibition

L’étude antimicrobienne adoptée dans ce travail est la méthode de diffusion en milieu solide qui utilise des disques vierges dont le diamètre est de 6 mm imprégné d'une concentration donnée des extraits des plantes médicinales testées. Chaque disque est déposé à la surface d'une gélose spécifique Mueller-Hinton (M H), préalablement ensemencé avec une culture pure des bactéries étudiées. Dés l’application des disques, l’extrait diffuse de manière uniforme où la concentration est inversement proportionnelle au diamètre du disque. Les boites ainsi préparées sont mise à l’incubation pendant 24 h à 37°C. Les disques s’entourent de zone d’inhibition circulaire. La sensibilité des bactéries est exprimée par la mesure du diamètre de la zone inhibée en mm.

c. Détermination de CMI et CMB

La détermination de la C.M.I. permet d'apprécier l'efficacité des agents antibactériens. Elle se définit comme étant la plus faible concentration inhibant totalement la prolifération d'un nombre défini de bactéries.

La CMB est la concentration de l’antimicrobien qui laisse au plus 0.01% de germes survivants. C’est la concentration qui inhibe la croissance de 99 p. cent des cellules d'une

souche bactérienne. Pour sa détermination, Nous cherchons à savoir à quoi ressemble 0,01% de survie par rapport au témoin de croissance. Sachant que le témoin de croissance représente 100% de survie.

 Préparation de la suspension bactérienne

Les 4 souches bactériennes testées ont été repiquées par la méthode des stries, puis incubées à l’étuve à 37°C pendant 24 heures afin d’obtenir une culture jeune. L'inoculum s’est fait à partir des colonies jeunes préparées à 24 heures.

A l'aide d'une anse de platine, une colonie, bien isolée, d’une culture pure de chaque souche a été introduite dans des tubes à essai. A cette culture 5ml de bouillon nutritif stérile ont été ajouté. Le tout a été porté à incubation pendant 3 à 5 heures à 37°C, pour avoir une pré culture. La suspension bactérienne est préparée de façon à obtenir un inoculum de 106 UFC/ml (UFC = unités formant colonies).

 Préparation de la gamme de concentration de la substance végétale

A partir de la solution mère 50 mg/ml d’extrait végétal. Nous avons préparé une gamme de concentration allant de C= 50 mg/ml, C1= 25mg/ml, C2=12.5 mg/ml, C3=6.25 mg/ml, C4= 3.12 mg/ml ; C5=1.56 mg/ml par la méthode d’une dilution selon une progression géométrique de raison 2. Les dilutions doivent être incorporées dans du bouillon qui est alors ensemencé avec le germe à tester.

Dans une série de 7 tubes C à C7, nous avons introduit 1ml d’extrait végétal selon la gamme de concentrations préparées à l'exception de dernier tube qui servira de témoin positif en ajoutant 1ml de l’eau distillée (la méthode de macro dilution).Ensuite, nous avons ajouté 1ml de bouillon nutritif (BN) dans l’extrait végétal de concentration bien connue. Ces tubes sont incubés à 37°C pendant 24 heures.

Après incubation, un trouble nettement visible est apparu dans ces tubes. A partir d'une certaine concentration, il n'y a plus de culture visible. La CMI est indiquée par le tube qui contient la plus faible concentration d'extrait où aucune croissance n'est visible [111].

a- Réalisation de la gamme de dilution de l’extrait

1ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1ml Rejeté

50mg/ml

C(solution mère ) C1 C2 C3 C4 C5

b- Ensemencement de chaque tube

1 ml de l’inoculum dans chaque tube 2ml finaux Inoculum C C1 C2 C3 C4 C5

c- Lecture après incubation à 37°C pendant 24h -Détermination CMI

C5 C4 C3 C2 C1 C

- - CMI (- ) + + ++ (+ Croissance (trouble).

Fig 15: La détermination de la CMI par macro dilution en tube  La détermination de la CMB

La CMB ne peut être déterminée que par macrométhode en milieu liquide. La CMB est la plus faible concentration en antibiotique pour laquelle on obtient au plus 0,01 % de bactéries survivantes de l'inoculum de départ (soit au maximum 1 bactérie pour 10 000 bactéries ensemencées).

Après avoir réalisée la recherche de CMI en milieu liquide nous effectuons la même procédure. Le pourcentage des germes survivants est déterminé par comparaison de la densité des colonies avec un témoin inoculum. Ce nombre est comparé au nombre de bactéries initialement présentes dans l'inoculum

100 µl de chaque tubes ensemencé sur milieu Muller Hinton (MH), le nombre de colonie le plus faible correspond aux tube qui contient l’extrait déterminé = CMB

f- Lecture après incubation à 37°C pendant 24 h

Photo 24: Antibiogramme (détermination de la CMB) 3. Résultats

3.1. Activité antimicrobienne : Zone d’inhibition

La recherche d'une activité antibactérienne a été réalisée sur une série de 22 espèces de plantes appartenant à 15 familles, traditionnellement utilisées par la population de l'Ouest algérien (tableau 15). Les souches bactériennes testées étaient Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. Si la zone d'inhibition supérieure à 15 mm de diamètre, nous considérons l'activité antimicrobienne comme très bonne. Si le diamètre est compris entre 15 mm et 8 mm, l'activité antibactérienne est moyenne. Pour des diamètres inférieurs à 8 mm, l'activité antibactérienne est faible. Sur les 368 tests effectués, 61 (16,6%) a montré une zone d'inhibition en dessous de 8 mm, 247 (67,1%) a montré une zone d'inhibition entre 8 mm et 15 mm et de 60 (16,3%) ont présenté une zone d'inhibition de plus de 15 mm. Nos résultats sont résumés dans le tableau 06.

Escherichia coli, Proteus mirabilis et Staphylococcus aureus ont présenté chacune une sensibilité de 28% en moyenne, alors que Pseudomona aerunginosa est connue comme être une bactérie résistante et très pathogène mais elle a présenté une sensibilité de 17.5 % envers les extraits des plantes. 16.3% de l’ensemble des extraits de plantes possède le potentiel

d’activité antimicrobienne le plus élevé (diamètre de la zone d’inhibition compris entre 15 et 20 mm).