Chapitre II: Matériel et méthodes
3. Méthodes utilisées
3.1. Détermination des données climatiques et édaphiques
Les mesures des paramètres climatiques des sites naturels, température, humidité de l'air, précipitation et vitesse du vent ont été enregistrées à partir des stations météorologiques agronomiques à proximité de chaque site sur la base de données climate-data.org, Allemagne. Les données de rayonnement solaire ont été obtenues par le service de données soda-pro.com, MINES ParisTech (France).
La mesure de la texture et des caractéristiques chimiques du sol pH, matières organiques totales, teneur en azote nitrique et azote ammoniacal) la teneur en éléments minéraux (phosphore, potassium, magnésium, calcium, fer, cuivre, zinc, manganèse, bore) a été effectuée par le laboratoire Teyssier (Bordeaux, France) à la demande du Parc du Luberon.
Les milieux Les phytohormones concentration mg / l
AIA BAP 2,4D MS 1 0,1 0,5 MS 2 0,1 1 MS 3 0,1 3 MS 4 1 0,5 MS 5 0,22 MS 6 1 MS 7 3 MS 8 0,5 1
3.2. Détermination des paramètres de croissance et de la teneur en eau
La croissance des plantes, pour chaque période considérée, a été déterminée par la mesure des poids frais et sec, et de la surface foliaire. Au stade floraison, la longueur de la tige florale, le diamètre du capitule et la densité des trichomes glandulaires ont également été déterminés.
3.2.1. Surface foliaire, poids frais et sec, et teneur en eau
Le poids frais a été mesuré immédiatement après la récolte, puis les feuilles ont été scannées pour mesurer leur surface foliaire avec le logiciel image-J (Instituts nationaux de santé, Etats-Unis). Les plantes collectées ont ensuite été séchées à 80° C pendant 24 h pour déterminer la masse sèche, puis la teneur en eau à partir de l’équation suivante : Teneur en eau % = ((PF-PS)/PF)* 100
3.2.2. Diamètre du capitule, longueur de la tige florale, densité des trichomes glandulaires La longueur de la tige florale et le diamètre des capitules ont été mesurés immédiatement après la récolte. La densité des trichomes glandulaires a été déterminée sur la face supérieure des feuilles et des bractées. Trois observations à la base, au milieu et à l’extrémité des feuilles, ont été effectuées en utilisant un stéréo-microscope (Nikon ZX 100, Canagawa, Japon) équipé de fluorescence (excitation 382 nm, émission 536 nm) et d'un appareil photo numérique (Leica DFC 300 FX, Wetzlar, Allemagne). Les images ont servi à quantifier les trichomes glandulaires à l'aide du logiciel l'image-J.
3.3. Détermination de la fluorescence de chlorophylle-a (chl-a)
Les réactions photosynthétiques chez les plantes supérieures se déroulent grâce à la collaboration de deux photosystèmes, PSI et PSII, dans la membrane des thylakoïdes (Hill & Bendall, 1960 ; Harris, 1978). L'énergie lumineuse est collectée par les antennes et elle est acheminée vers les centres réactionnels (CRs) de chaque photosystème, où une séparation de charge se produit le complexe dégageant de l'oxygène (OEC) passe à travers quatre étapes d'oxydation successives (appelés états S stables) afin de réduire la phéophytine de l’eau et de produire O2 (Harris, 1978 ; Dekker, Ghanotakis, Plijter, Van Gorkom, & Babcock, 1984). Deux quinones sont situées dans le PSII : QA reçoit les électrons de la réduction de la phéophytine (Pheo-) (l'accepteur d'électrons primaire). Ensuite l'électron est transféré vers l'accepteur secondaire QB, le plastoquinol (PQH2) est
formé par double réduction de QB. PQH2 est ensuite échangé contre une molécule PQ dans la membrane des thylakoïdes (Petrouleas & Crofts, 2005).
La fluorescence de chlorophylle-a peut fournir des informations détaillées sur le fonctionnement de l’appareil photosynthétique, en particulier sur le PSII (Strasser, Tsimilli-Michael, & Srivastava, 2004). La fluorescence peut donner un aperçu de la capacité d'une plante à tolérer des conditions environnementales dans la mesure où des contraintes ont endommagé l'appareil photosynthétique, (Maxwell & Johnson, 2000), il peut être un excellent outil pour étudier les changements induits par les stress (Naumann, Young, & Anderson, 2008).
Le test OJEP est basé sur un modèle, décrit comment l'énergie des photons absorbés par les pigments photosynthétiques dans l'antenne du PSII (ABS), est dissipée sous forme de chaleur et de fluorescence (DI) (Figure 3), et transmise deux centres réactionnels du PSII (CRs) (conduisant à la réduction QA), et ensuite converti flux d’électrons (ET) (Strasser et al., 2004; Stirbet & Govindjee, 2011).
Figure 3 : Cascade d’énergie de la lumière solaire au photosynthétique transport photosynthétique d'électrons dans le photosystème II, d’après Strasser et al., (2004).
OJIP, Фp0 = Fv / Fm = (Fm-F0) / Fm qui représente la efficacité photochimique
maximale du PSII. Le flux d'énergie spécifique exprimé par le centre réactionnel (RC) : le taux d'absorption des photons ABS/RC = (TR0/RC) / [(Fm – F0) /Fm], le taux d’électrons transféré (ET0) au-delà de QA- ET0/RC = (TR0/RC) (1 - Vj) = (TR0/RC) (ET0 / TR0), le taux de dissipation de chaleur DI0/RC = (ABS/RC) - (TR0/RC) et l’indice de performance [RC/ABS] [(TR0/ABS)/(F0/Fm)] [(ET0/TR0)/Vj].
3.4. Détermination de la teneur en flavonoïdes, polyphénols et lactones sesquiterpènes
Les analyses des teneurs en flavonoïdes, polyphénols et lactones sesquiterpènes ont été effectuées par Laboratoire de Pharmacognosie-Ethnopharmacologie (UMR-MD3), de la Faculté de la Pharmacie, de l’Université d’Aix-Marseille.
3.4.1. Dosage des flavonoïdes totaux
La teneur totale en flavonoïdes a été déterminée selon la méthode colorimétrique. 3.4.1.1. Préparation des solutions à analyser
Pour préparer la solution témoin, 10 mg de lutéoléine (Lot: 0052, Extra synthèse) sont pesés et transvasés à l’aide d’éthanol à 50% (environ 20 ml) dans une fiole jaugée ambrée de 50 ml. Puis, ils sont homogénéisés avec des ultrasons pendant 5 min, puis ajustés et homogénéisés au trait de jauge avec le même solvant EtOH (50%).
Les extraits ont été préparés en mélangeant 2 g de matière sèche avec 20 ml d'EtOH (50%) puis ils ont été mis à macérer pendant 96 heures. Ils sont ensuite agités avec des ultrasons pendant 30 minutes et filtrés sous vide sur un filtre 0,45µm.
3.4.1.2. Dosage et calcul
0,5 ml de l’extrait ont été mélangés avec 1 ml de réactif au chlorure d’aluminium, dans une fiole jaugée de 25 ml. Le mélange est ajusté au trait de jauge avec une solution d’acide acétique glacial à (5%) dans du méthanol. Le mélange est alors homogénéisé puis laissé reposer 30 minutes à l'abri de la lumière. La mesure a été effectuée à l'absorbance λ=396 nm.
La solution de compensation a été préparée en ajoutant 1 ml de solution témoin à 1 ml de méthanol et ajustée avec une solution d’acide acétique glacial à 5% dans du méthanol. La teneur en flavonoïdes totaux est exprimée en lutéoléine à partir de l’équation suivante :
Teneur en % (g/100g de matière végétale) = 0, 4 Abs 0, 418 3.4.2. Dosage des polyphénols totaux
La teneur phénolique totale a été déterminée avec le dosage de Folin-Ciocalteu. 3.4.2.1. Préparation des solutions à analyser
La solution témoin a été préparée en ajoutant 10 mg de pyrogallol (Lot: 23530 - Riedel-de-Haën) dans une fiole jaugée de 100 ml avec de l'éthanol à 50% complétée jusqu'au trait de jauge avec le même solvant.
Les extraits sont préparés en mélangeant 2 g d’échantillon secs avec 20 ml d'EtOH (50%). Ils sont mis à macérer pendant 96 heures. Ils sont ensuite agité avec des ultrasons pendant 30 minutes, puis filtrés sous vide sur 0,45µm avant analyse et dilués au 1/25 avec de l'EtOH (50%).
3.4.2.2. Dosage et calcul
5 ml de la solution témoin ou de l’extrait dilué est introduit dans une fiole jaugée de 100 ml. 1,0 ml de réactif de Folin-Ciocalteu et 4,0 ml de solution de carbonate de sodium à 7,5% (m/v) ont été ajoutés au mélange, puis complées au trait de jauge avec de l'eau R. Le mélange est laissé pendant 2h30 à l'étuve à 30°C à l'abri de la lumière. La mesure est effectuée à l'absorbance λ=760 nm. La solution de compensation a été préparée avec de l’eau R. La teneur en polyphénols totaux est exprimée en pyrogallol (dont l'absorbance à 0,1 mg/ml est à 0,528)
Teneur en % (g/100g de matière sèches)
4 , 0 528 , 0 Abs
3.5. Analyse qualitative et quantitative par CLHP des constituants majeurs d’I. montana 3.5.1. Les appareillages et les conditions chromatographiques
Un système Agilent liquide de chromatographie 1200 séries (Agilent Technologies Deutschland, Waldbronn, Allemagne), équipé d’une pompe quaternaire (G1311A), d’un dégazeur (G1379A), d’un injecteur automatique (G1329A), d’un détecteur UV486-détecteur à barrettes de diodes (996 G1315B), et d’une station de travail Agilent et systèmes de données chromatographiques (B.02.01), a été utilisé pour l'analyse quantitative des lactones sesquiterpènique et des autres constituants majeurs dans les feuilles et les capitules d’I. montana. L'analyse quantitative a été effectuée sur une
L’absorption UV a été contrôlée à 210 nm. La température de la colonne a été réglée à 25 ° C. Le débit est de1.0 ml / min et le volume d'injection d'échantillon de 20 µl.
3.5.2. Préparation de l'extrait dans le dichlorométhane et de la solution d'essai
10 g de feuilles ou de capitules secs ont été mélangés avec 100 ml de CH2Cl2. Le mélange est introduit dans une colonne en verre. Après 18 heures de macération, 100 ml de percolât sont recueillis et une évaporation à sec est réalisée sous pression réduite. 10 mg de l'extrait de dichlorométhane ont été pesés et transférés dans une fiole jaugée de 10 ml ajusté avec 5 ml de méthanol et complétés avec de l'eau distillée. Le surnageant de la solution a été filtré à travers une membrane de 0,45 µm avant l'analyse par HPLC.
Les parties ariennes des plantes cultivées à Mérindol ont été récoltées au début de la manip (J0), juste après l’ombrage (J14), et à la fin de la manip (J28) pour l’expérience variation d’éclairement. Alors que deux prélèvements ont été réalisés au début de la manip et à la fin pour le stress salin, et le traitement d’UV-B. Toutes les échantillonnes ont été séchés à l'air sur du papier absorbant dans des conditions ambiantes.