Méthodes spectroscopiques : structure de la matrice fromagère

III.4.1.

Généralités sur la spectroscopie

Les techniques de spectroscopie sont rapides, d’un coût de fonctionnement faible et peuvent apporter de nombreuses informations. (Birlouez-Aragon et al. 2002; Karoui et al. 2005). Ces techniques sont considérées comme sensibles, non destructives, rapides, non invasives. Ces méthodes nécessitent une préparation simple des échantillons et elles peuvent être prédictives. (Karoui and Dufour 2006; Karoui et al. 2008; Woodcock et al. 2008). Ces dernières années, des méthodes spectroscopiques ont été développées pour contrôler la qualité des productions en incluant différentes mesures couvrant une large partie du spectre électromagnétique : absorption dans le visible et l’ultra-violet, émission de fluorescence, absorption dans le moyen et proche infrarouge, résonnance magnétique nucléaire, absorption par microonde…Ces différentes méthodes ont permis de suivre simultanément plusieurs paramètres de qualité (Belton 2000, Kulmyrzaev and Dufour 2008).

Le moyen-infrarouge a été utilisé pour étudier les produits laitiers pour par exemple suivre l’évolution des interactions protéiques au cours de l’affinage de fromage (Mazerolles et al. 2001).

La spectroscopie de fluorescence a permis de suivre la qualité des laits au cours de différents traitements : l’homogénéisation, le chauffage ou l’acidification des laits, l’affinage des fromages, le chauffage de fromages à pâte pressée, l’origine géographique des fromages mais également la qualité de nombreux autres produits issus de différents secteurs de production (Karoui et Blécker, 2010).

Du point de vue technique, la spectroscopie photonique repose sur l’étude de l’interaction d’une onde électromagnétique avec la lumière. Le spectre électromagnétique est

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divisé en diverses régions en fonction de la longueur d’onde des radiations (figure n°11). Chaque région est associée à un type de transition atomique ou moléculaire différentes mettant en jeu des énergies différentes. Les photons de la lumière transportent de l’énergie liée à la fréquence de radiation. Lorsque la lumière traverse une matière non transparente, elle est absorbée partiellement. Dans le domaine de l’UV ou du visible, l’énergie lumineuse absorbée par la matière fait passer les électrons d’une molécule d’un état fondamental stable à un état de plus haute énergie instable. Lorsque la molécule retourne à son état fondamental, elle cède de l’énergie au milieu soit sous forme de lumière (luminescence), soit sous forme de chaleur ou soit sous forme de fluorescence.



III.4.2.

Spectroscopie de fluorescence :

La fluorescence correspond à l’émission de photons par certaines molécules excitées à l’aide d’une radiation lumineuse dans l’ultraviolet et le visible (Lakowicz, 1983). Le temps (10^-9à 10^-7secondes) durant lequel la molécule reste excitée, est caractéristique de celles-ci. Cette émission de photons est appelée fluorescence, le signal enregistré à différentes longueurs d’onde constitue le spectre d’émission de fluorescence. Le photon émis a moins d’énergie que celui d’excitation. Donc pour une molécule donnée, les longueurs d’onde d’émission seront supérieures à celles d’excitation et l’énergie des photons de fluorescence sera plus faible que celle des photons d’excitation.

La spectroscopie de fluorescence donne des informations sur la présence de molécules fluorescentes et sur leur environnement. Elle permet d’observer l’évolution de la conformation d’un constituant contenant ces molécules et de ses interactions (protéine, lipides, eau…) en fonction du traitement qu’il subit dans son environnement : hydratation, coagulation, protéolyse et lipolyse de l’affinage, fonte ou cristallisation de triglycéride…Les acides aminés aromatiques (Dufour et al 1994), les produits d’oxydation des lipides (Gatellier et al 2007) ont des propriétés de fluorescence. Ils ont été utilisés pour étudier la structure des protéines et des lipides et leurs diverses interactions. Ceux sont des fluorophores intrinsèques aux produits qui sont utilisés comme marqueurs spécifiques d’un constituant tels que les résidus tryptophane de la caséine (Fox, 1989), les vitamines comme la vitamine A des membranes des globules gras (Dufour et al 2001), les cofacteurs enzymatiques comme le NADH et la riboflavine révélatrice de l’état d’oxydation des produits car très sensible à la

lumière et à la présence d’oxygène (Kristensen et al 2000). L’ensemble de ces sondes intrinsèques se retrouve dans les fromages, mais il existe de nombreuses autres possibilités de composés ayant des propriétés de fluorescence : certains terpènes issus de la flore botanique, les acides gras insaturés conjugués, les composés phénolique si le produit est fumé… Il est possible également d’utiliser des sondes extrinsèques spécifiques de certains constituants (Herbert et al, 1999).

La fluorescence à angle droit a été utilisée pour étudier des solutions diluées. Les produits agroalimentaires solides ou viscoélastiques ne peuvent pas être étudiés par cette méthode.

La spectroscopie de fluorescence frontale permet de contourner ce problème en étudiant uniquement la surface de l’échantillon (Genot et al 1992b) (figure n°12). Les photons émis sont collectés sous un angle de 54° par rapport à l’échantillon pour minimiser la collection de photons réfléchis.

La spectroscopie de fluorescence synchrone présente l’avantage de pouvoir caractériser plusieurs fluorophores à partir d’un seul spectre. Cette technique très répandue dans le domaine de la pétrochimie n’a été que récemment exploitée en agroalimentaire : pour discriminer des huiles issues de différents espèces variétales (Poulli, 2007), pour étudier les changements structurales des laits au cours du chauffage ou de l’acidification et des fromages à pâte pressé au cours de la fonte (Boubellouta, 2008). Pour cette méthode, la longueur d’onde d’excitation et celle d’émission varient simultanément tout en gardant entre elles un décalage constant Δλ. Pratiquement, on choisit une longueur d’onde d’émission de départ supérieure de quelques nanomètres à la longueur d’onde d’excitation, puis les monochromateurs défilent à la même vitesse (Patra et Mishra, 2002) (figure n°13, 14).

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