Méthodes

3.1. Extraction des composés bioactives

Parmi les différentes étapes que constituent l‗analyse et l‘identification de molécules bioactives, l‘étape d‘extraction, qui a pour but la désorption des molécules d‗intérêt des sites actifs de la matrice végétale, est primordiale puisqu‗elle déterminera la nature et la quantité des molécules extraites et par conséquent le succès des étapes qui succèdent. L‘extraction de produits naturels est généralement de type solide-liquide. C‘est-à-dire qu‘un solide, la matrice végétale, est mélangé avec un liquide, le solvant d‘extraction. Des méthodes dites traditionnelles, comme la macération à froid avec l‘eau distillée ou les solvants de différentes polarités, le Soxhlet, la décoction et l‘hydro-distillation.., étaient jusqu‘ici utilisées et considérées comme techniques de choix pour extraire les composés naturels.

Le procédé d‘extraction appliqué dans cette investigation est la technique de macération par un mélange hydro-alcoolique (hydro-éthanolique), méthode proposée par Mahmoudi et al. (2013) et Bourgou et al. (2016), légèrement modifiée. Pour chacun des échantillons, cent grammes (100g) de

Partie expérimentale Chapitre I: Matériels et méthodes

33 matière végétale sèche et finement broyée a été mélangée avec 350ml d‘éthanol aqueux (70/30: v/v), pour assurer une extraction maximum des principes actifs de la plante. La procédure a été réalisée à l‘obscurité et à la température ambiante pendant trois jours successifs, avec renouvellement du solvant chaque 24 heures.

Après avoir été filtré sous vide à l‘aide d‘un papier en microfibre de verre de Whatman #1, les trois macéras ont été mélangés. Ensuite, le solvant a été évaporé sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif (Rota-Vapore, Büchi R 210) à une température de 40° C (Fig. 16). Les concentrés ainsi obtenus ont été conservés à -20° C. La lyophilisation constitue la dernière étape pour l‘obtention de l‘extrait sec (Lyophilisat).

Matière végétale broyée

24h d’incubation à température ambiante et à l’ombre

Décantation et Filtration des macéras à l’aide de papier Whatman #1

Elimination du solvant par un Rotavapor à 40°C

Macération dans l‘éthanol 70%

(3fois, pendant 3 jours (70/30 : v/v)

Lyophilisation de l’extrait éthanolique brut

Conservation de lyophilisat à -20°C

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34 3.2. Analyse quantitative des molécules bioactives

3.2.1. Estimation du rendement d’extraction

Le rendement d‘extraction (R) a été calculé selon la formule de Falleh et al. (2008):

Où : R est le rendement en %; Mext est la masse de l‘extrait après lyophilisation en g et Méch est la Masse de la matière végétale sec.

3.2.2. Dosage des composés phénoliques totaux (CPT)

Le principe de l‘analyse quantitative des polyphénols totaux est le suivant: le réactif est constitué d‘un mélange d‘acide phosphotungstique (H

3PW12O40) et d‘acide phosphomolybdique (H3PMo12O40)

de couleur jaune. Il est réduit, lors de l‘oxydation des phénols, en un mélange d‘oxydes bleus de tungstène et de molybdène (Ribéreau, 1968 ; Vermerris et al., 2006).

La coloration produite, dont l‘absorption maximum est comprise entre 725 et 760nm, est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans les extraits végétaux (Boizot et Charpentier, 2006).

Ce dosage a été effectué, selon la méthode décrite par Do et al. (2014), il permet de connaitre le contenu polyphénolique total d‘un échantillon donné. Les extraits éthanoliques des feuilles et des tiges, préparés à une concentration de 1mg/ml, ont été ajoutés à 5ml (dix fois diluée) du réactif de Folin-Ciocalteu et 4ml de carbonate de sodium (7,5%). Parallèlement, dans les mêmes conditions, une gamme d‘étalon a été préparée avec de l‘acide gallique à des concentrations variant de 0 à 100µg/m1. Après une heure d‘incubation à la température ambiante et à l‘abri de la lumière, l'absorbance a été lue à 765nm sur un spectrophotomètre UV (Jenway 6715).

Le contenu phénolique total a été exprimé en mg équivalent d‘acide gallique/g de "Lyophilisat" (mg EAG/g LE). La teneur en ce composant par rapport à 1g de matière sèche a été également calculée (mg EAG/g MS) en se référant à la courbe d‘étalonnage.

La droite de régression de l‘acide gallique nous permet l‘appréciation des valeurs des concentrations et des teneurs en polyphénols totaux des deux parties aériennes d’A. halimus, pour des absorbances obtenus.

Dans le but d‘approfondir notre recherche et de déterminer les différents molécules bioactives présents dans les échantillons testés et qui peuvent être responsables des activités biologiques (Antioxydantes et antifongiques), une étude qualitatives complémentaire aux screening a été procédée par la méthode de chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP).

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35 3.2.3. Quatification des flavonoïdes totaux (FT)

La détermination de la teneur et la concentration des flavonoïdes totaux des extraits éthanoliques des feuilles et tiges a été réalisée par la méthode de trichlorure d‘aluminium décrite par Ahn et al. (2007). Le principe de la méthode est basé sur l‘oxydation des flavonoïdes par le trichlorure d‘aluminium. Elle entraîne la formation d‘un complexe jaune qui absorbe à 430nm. Où un volume de 0,5ml d‘une solution de AlCl3 2%-éthanol était additionné à 0,5ml d'échantillon ou d'étalon. Après

10min à la température ambiante, l'absorbance a été mesurée. La Rutine, à des concentrations croissantes allant de 0 à 1000µg/ml, a été utilisée comme standard pour tracer la courbe d'étalonnage. La comparaison de la D.O observée par rapport à celles obtenues par l‘étalon de concentrations connues permet d‘évaluer la concentration et la teneur en flavonoïdes totaux (TFT). Les résultats ont été exprimés en milligramme équivalent Rutine par gramme de lyophilisat (mg ER/g LE) et par gramme de matière sèche (mg ER/g MS).

3.2.4. Dosage des flavonols totaux (FLT)

Les flavonols est l‘une des classes principales des flavonoïdes. Les flavonols présentent des propriétés antioxydantes qui peuvent être déterminées suivant la méthode décrite par Liu et al. (2007). Approximativement, 1ml des extraits ont été mélangés avec 1ml de trichlorure d‘aluminium AlCl3 (2mg/ml) et 3ml de la solution d‘acétate de sodium (50mg/ml). Le mélange a été gardé pendant

2,5h à la température ambiante, puis dosé à la longueur d‘onde de 440nm, à l‘aide d‘un spectrophotomètre UV-Visible (Jenway 6715). Parallèlement, différentes concentrations de Rutine ont été employées comme solution étalon allant de 0 à 100µg/ml.

Les teneurs et les concentrations en flavonols ont été exprimées respectivement en milligramme équivalent standard (Rutine) par gramme de matière sèche (mg ER/g MS) et d‘extrait "Lyophilisat" (mg ER/g LE).

3.2.5. Quantifications des Caroténoïdes totaux (C)

Les colorants naturels ou « Pigments » dans la plupart sont d‘origine végétale, forment une gamme très étendus de nuances (du jaune au bleu, en passant par le vert et même le noir). La chlorophylle, le lycopéne et le ß-caroténe sont parmi les colorants les plus rencontrés et les plus utilisés dans les industries agroalimentaires. A des doses réglementées, ils sont bénéfiques pour la santé. Certains d‘entre eux sont connus pour leurs activités antioxydantes, antimutagènes, voire anticarcinogénes (Kamat et al., 2000 ; Ben Mansour et Latrach-Tlemcani, 2009).

Dans le but de quantifier les caroténoïdes présentes dans les extraits éthanoliques de l‘A. halimus, la méthode de Sass-Kiss et al. (2005) a été choisie; soit 100mg de lyophilisat, ainsi que différentes concentrations de β-carotène (0 à 10µg/ml) utilisées comme référence, ont été

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36 homogénéisés avec 10ml d‘un mélange de solvant hexane/acétone/éthanol (2:1:1 : v/v/v). Le surnageant a été ajusté à 10ml d‘hexane après centrifugation pendant 15mn à 2250tpm. L‘absorbance de la solution a été mesurée à 450nm. Les concentrations en caroténoïdes ont été exprimées en milligramme équivalents β-carotène par gramme d‘extrait lyophilisé (mg EβC/g LE). Ajoutant que la teneur de la matière sèche en ces pigments a été également évaluée (mg EβC/g MS).