Méthodes nécessitant un marquage des cellules

Le domaine de caractérisation et de tri cellulaire par marquage est dominé par deux principales méthodes : le FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) et le MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) qui font intervenir respectivement, un marqueur fluorescent ou magnétique.

II.1.1. Cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technique largement répandue dans les laboratoires de biologie pour analyser des cellules dans une population hétérogène en se basant sur le marquage des cellules d’intérêts par des anticorps couplés à des fluorochromes. Dans un cytomètre en flux (Figure.1), les différents types de cellules en suspension sont injectés dans un flux à grande vitesse et ont été au préalablement marqués avec des anticorps spécifiques aux cellules cibles. En utilisant un système de concentration hydrodynamique, les cellules s’alignent au centre du système et par la suite elles passent une par une devant un faisceau laser. Chaque fois qu’une cellule passe dans la zone où le laser est focalisé, elle provoque une diffusion de la lumière. De plus, dans le cas où la cellule irradiée par le laser possède sur sa surface des marqueurs fluorescents, un signal de fluorescence sera émis. La lumière diffusée et le signal de fluorescence sont détectés avec un système de couplage optique-électronique et enregistrés sur un ordinateur. L’intensité de la lumière diffusée fournit des informations sur la taille et la granularité (structure interne) de la cellule et le signal de fluorescence renseigne sur la présence ou non de marqueurs.

Les cytomètres en flux peuvent être équipés d’un module de tri afin de séparer et de dévier les particules analysées dans différents réservoirs de collecte. Cet équipement est connu sous le nom de Fluorescence activated cell sorting (FACS) (Figure.1). En effet au moment où la cellule coupe le faisceau laser, un système de vibration provoque le fractionnement du flux en gouttelettes. Ensuite selon le signal fluorescent émis, chaque gouttelette contenant une cellule individuelle est chargée électriquement. En fonction de leur charge, les gouttelettes sont déviées avec un système de déflexion électrostatique vers différents tubes de collecte. Les cellules cibles sont alors séparées des cellules non désirées [1]–[3].

Fatima HJEIJ | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2018 31

Le FACS est une technique d’analyse et de tri cellulaire performante considérée comme méthode de référence par les biologistes. Elle est capable de séparer en même temps plus de six populations cellulaires différentes [1]. Le tri des cellules se fait avec une précision très élevée (analyse cellule par cellule), cela permet d’obtenir un taux de pureté très important (> 95%) [1], [2]. En plus, cette méthode permet de séparer plus de 70 000 cellules/seconde [4]. Néanmoins, le FACS reste une technique de tri relativement complexe qui comprend trois parties : le système fluidique, le système optique et la partie électronique. Le transport des cellules dans un flux à grande vitesse et la génération des gouttelettes peuvent endommager la viabilité des cellules séparées [5], [6]. De plus, le tri par FACS est une méthode relativement coûteuse en termes de coût à l’achat de l’équipement (typiquement autour de 280 000 euros) mais aussi en termes de coût d’utilisation lorsque l’on doit coupler plusieurs types de marqueurs fluorescents

[7].

Figure.1 Schéma décrivant la séparation des cellules par la méthode de FACS [8].

Parmi les techniques de tri par marquage reconnues, les méthodes de tri magnétique (MACS) sont également très souvent utilisées. Les cellules sont dans ce cas marquées par des nanoparticules magnétiques comme nous allons le voir dans ce qui suit.

Suspension cellulaire Cellules cibles Détecteur Ordinateur Déflecteur électromagnétique Récupération des cellules cibles Module de tri activé par fluorescence Courant +/-Fenêtre de détection optique Formation de gouttelettes Système d’écoulement fluidique LASER Cytomètre en flux

Fatima HJEIJ | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2018 32 II.1.2. Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)

La méthode de Magnetic activated cell sorting permet le tri et l’isolation des cellules d’une population biologique en utilisant des nanoparticules magnétiques couplées à des anticorps spécifiques. Elle a été développée par Miltenyi en 1989 qui a utilisé une colonne remplie par des particules ferromagnétiques pour accentuer l’efficacité de séparation des particules [9]. Le principe de séparation des cellules est décrit sur la Figure. 2.

Figure. 2 Principe de séparation des cellules par Magnetic activated cell sorting [10].

La population cellulaire en suspension est incubée avec des particules magnétiques de taille nanométrique possédant sur leurs surfaces des anticorps spécifiques aux cellules cibles. Les cellules d’intérêt sont alors marquées par les nanoparticules alors que les autres cellules restent sans étiquette. Comme les nanoparticules possèdent un petit diamètre de l’ordre de 50 nm, il est nécessaire de générer un gradient de champ magnétique intense pour attirer les cellules marquées. Pour cela, une colonne remplie de billes de fer est placée dans un aimant ; les billes de fer concentrent fortement les lignes de champ magnétique de façon à générer une force magnétique importante qui sera appliquée aux particules. Ensuite, la suspension cellulaire est injectée dans la colonne, les cellules accrochées aux particules magnétiques sont retenues par la force magnétique et elles restent alors dans la colonne. Ainsi, les cellules non marquées (également appelées fraction négative) sont éliminées en rinçant la colonne avec une solution tampon. Ensuite en retirant la colonne du champ magnétique externe, les particules ferromagnétiques perdent leur aimantation et les cellules cibles (également appelées fraction positive) sont récupérées par élution en rinçant la colonne avec une solution tampon [11]–[13].

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Ce tri magnétique permet de trier 10¹¹ cellules/heure et il possède généralement un rendement de pureté d’environ 75% [14]. L’utilisation de cette méthode de tri dépasse aujourd’hui le cadre des laboratoires de recherche, elle est en effet commercialisée et utilisée couramment dans le domaine biomédical [15], [16]. De plus, elle est utilisée pour l’isolation de cellules rares du sang, en particulier dans le cas des circulating tumor cells (CTCs) [17], [18]. Néanmoins le système MACS présente l’inconvénient majeur d’avoir un coût non négligeable et il nécessite un certain temps pour la préparation de l’échantillon [5]. En outre l’attachement des particules nanométriques aux cellules peut entraîner la modification du comportement des cellules analysées. Et dans le cas où l’oxyde de fer peut s’échapper des particules magnétiques, une contamination de l’échantillon peut se produire [19].

Ces deux techniques de séparation, le FACS et le MACS, nécessitent toutes deux le recours à des marqueurs spécifiques qui se fixent aux récepteurs cibles de la membrane cellulaire. L’usage des marqueurs présente certains inconvénients notamment en termes de coût d’achat des anticorps marqués et de temps de préparation de l’échantillon, le comportement et les propriétés des cellules marquées peuvent être influencés par le marqueur et les cellules peuvent difficilement être réutilisées après analyse pour des investigations supplémentaires par exemple. En outre, les marqueurs que ce soit des anticorps fluorescent ou des nanoparticules magnétiques peuvent être considérés comme des contaminants qui peuvent interférer avec la prolifération et la différenciation cellulaire [20]–[22]. De plus, l’utilisation de marqueurs dans le cas de certains types cellulaires comme les cellules souches présente des limites. En effet, de par leur phénotype indifférencié, il est difficile de cibler des marqueurs spécifiques pour ces cellules. Par exemple, le CD133, l’un des marqueurs les plus utilisé pour caractériser les cellules souches cancéreuses, a été remis en cause par la communauté scientifique [23]. En effet il se trouve qu’il n’est pas exprimé uniquement par les cellules souches, mais également exprimé par des cellules différenciées. En effet, c’est le cas de nombreux autres marqueurs et notamment des marqueurs que l’on a cru un moment spécifiques et pour lesquels des doutes sont apparues par la suite.

Cette absence de marqueurs spécifiques a encouragé ces dernières années le développement de méthodes de caractérisations et de tri alternatives, où le recours à des marqueurs ne serait plus nécessaire.

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Ces techniques dites « label-free » sont basées sur l’évaluation de critères physiques comme l’indice de réfraction ou les propriétés diélectriques de la cellule ou encore des critères taille/densité et taille. Nous allons présenter ces méthodes dans la partie suivante en nous focalisant en particulier sur la diélectrophorèse qui fait l’objet de ces travaux de thèse.