Méthodes immunochimiques

La liaison de l’antigène à l’anticorps in-vitro produit une réaction soit directement visible à l’œil nu, soit détectable par une variété de moyen technique qu’elle est toutefois possible de simplifier :

Les premiers tests, qualifiés de réaction de 1^ère catégorie, caractérisent des réactions dont les immunocomplexes apparaissent sous une manifestation visible en cours de réaction. Les autres tests dénommés réaction de 2^émecatégorie, caractérisent des réactions qui utilisent un marqueur de l’antigène ou de l’anticorps, tels que le test ELISA, l’Immunofluorescence et la radio-immunologie (RIA, radioimmunoassay) (Beraud, 2001).

II.5.1 Méthodes sans marqueurs II.5.1.1 Immunoprécipitation

Ces dosages ont été les premiers à être mis au point et leur élaboration était généralement très simple, ils ont l’avantage de pouvoir être réalisés avec un matériel et des réactifs peu onéreux, mais leur sensibilité est relativement faible. Etant basés sur la précipitation des complexes Ag-Ac, ils nécessitent, pour être performants, un rapport de concentrations Ag/Ac proche du point d’équivalence. Dans le cas contraire, c'est-à-dire en cas d’excès de l’un ou l’autre, les complexes sont solubles et donc peu détectables (Paraf et Peltre, 1992).

La réaction de précipitation se fait en milieu liquide soit en milieu gélifié. Le temps de réaction varie de moins d’une heure à plusieurs jours. La lecture peut se faire, soit à l’œil nu, soit avec des appareils tels que le néphélomètre ou le turbidimètre (Audigié et al, 1983).

03 II.5.1.2 Immunoagglutination

Les méthodes d’agglutination sont nées des l’observation de l’agglutination de bactéries par le sérum de malade et de l’agglutination des hématies par le sérum de sujets appartenant à des groupes sanguins différents dans le système A.B.O (Masseyeff, 1997).

La réaction d’agglutination met en présence des Ag de nature insoluble (cellule, érythrocytes, bactéries, macromolécules) et un immunsérum contenant des Ac spécifiques agglutinants. Cette réaction est spécifique et plus sensible que la réaction de précipitation (Dainat et al, 2001).

Ces méthodes sont très sensibles, à peu prés au même niveau que l’ELISA ou le RIA. Elles sont d’exécutions simples, rapides, faciles à interpréter et ne demandent aucun matériel particulier. La réaction d’agglutination peut être passive ou active, soit directe ou indirecte (Masseyeff, 1997).

II.5.2 Méthodes utilisant un réactif marqué

Lorsqu’elle est opérée dans des zones de faibles concentrations des réactifs (Ag ou Ac), la réaction Ag –Ac ne donne lieu à aucun phénomène directement observable. Pour remédier à cela, il suffit de marquer l’un des partenaires de la réaction par une substance susceptible d’émettre un signal identifiable par l’œil nu ou par un appareil spécialisé. Ces marqueurs sont solidement fixés à l’Ag ou à l’Ac par une liaison covalente.

Un grand nombre de marqueurs (traceurs) différents ont été proposés mettant au point un grand choix de techniques de marquage (Tableau 2) (Lafont, 2005)

Tableau 2: Méthodes utilisant un marqueur (Lafont, 2005)

Traceur Dosage avec compétition Dosage sans compétition

Radiomarqué Radioimmunoassay (RIA) Immunoradiometric assay

(IRMA)

Enzyme Enzymoimmunoassay (EIA) Enzyme-labeled immunosorbent assay

(ELISA)

Fluorescent Fluoroimmunoassay (FIA) Immunofluorometric assay

(IFMA)

II.5.2.1 Méthodes radio-immunologiques

Ces techniques reposent sur l’utilisation d’Ag ou d’Ac marqués avec un isotope radioactif (³H, ¹⁴C ou ¹²⁵I). Elles sont de moins en moins utilisées pour plusieurs raisons : nécessité que le laboratoire soit habilité à manipuler les radioéléments et présentent des

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inconvénients liés à l’utilisation de traceurs radioactifs, coûts des systèmes de la radioactivité, durée de vie des réactifs qui est limitée par la demi-vie des isotopes (60 jours pour¹²⁵ I), contamination polluantes des déchets. Elles ne sont plus guère employées qu’en recherche ou pour étalonner les méthodes nouvelles (Adrian et al, 1998).

II.5.2.2 Immunofluorescence

Technique qui consiste à révéler des motifs antigéniques par la fixation d’un fluorochrome, les fluorochromes les plus utilisés sont l’isothiocyanate de fluorescéine et la rhodamine, la lecture se fait au microscope éclairé par la lumière ultra-violette. La réaction Ag-Ac fait apparaitre des zones de fluorescence (Figure 10) (Genetet, 2002)

Les méthodes d’immunofluorescence permettent d’identifier des cellules caractérisées par l’expression de marqueurs de différenciation, de déterminer leur fréquence au sein de populations cellulaires hétérogènes, et de quantifier l’expression des marqueurs étudiés par appréciation de la densité des molécules. Les méthodes de marquage multiple, utilisant simultanément plusieurs anticorps de spécificités différentes couplés à des fluorochromes distincts se prêtent à une identification fine des constituants d’une suspension cellulaire (Genetet, 2002).

Figure 10: Méthodes Immunofluorescence directe et indirecte (Genetet, 2002)

II.5.2.3 Méthodes immunoenzymatiques

Immunoenzymologie fait appel à des techniques ou les réactifs sont marqués par une enzyme dont l’activité est détectable par l’addition d’un substrat qui donne un produit coloré ; la lecture se fait à l’œil nu ou se mesure à l’aide d’un colorimètre.

On distingue deux grands types d’immunodosages utilisant un marqueur selon le réactif (Ac) est limitant ou en excès par rapport à l’Ag à doser.

La méthode ELISA est une technique immunochimique. Elle exploite la faculté de certaines protéines utilisées par le système immunitaire, les anticorps, à détecter certaines protéines, les antigènes, de manière spécifique. La technique utilise deux anticorps : l'un est

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spécifique de l'antigène et va donc venir s’y fixer, tandis que l'autre réagit aux complexes antigène-anticorps formés et est couplé à une enzyme qui, en catalysant une réaction biochimique, va émettre un signal. L’intensité de ce signal révèlera la quantité de complexes anticorps antigène et donc de l’antigène recherché (Liu et al, 2006).

Ces techniques sont basées sur deux types de procédés.

- Un procédé qui fait appel à un support solide pour immobiliser l’un des composés de réaction afin de faciliter la séparation des réactifs non liés : ce sont les dosages en phase hétérogène.

- Un procédé dans lequel aucune séparation n’est nécessaire car le dosage du complexe Ag-Ac-enzyme s’effectué directement dans le mélange réactionnel, en milieu liquide : ce sont les dosages en phase homogène (Liu et al, 2006).