Méthodes historiques

La RFLP (restriction fragment length polymorphism) est une des premières méthodes appliquées au génotypage de S. aureus. Une enzyme de restriction reconnaissant une courte séquence spécifique d’ADN est utilisée pour couper l’ADN génomique du micro-organisme étudié en fragments, qui sont ensuite séparés par migration sur gel en fonction de leurs tailles (44). Les sites de coupure dépendant du contenu génomique, chaque organisme possède son propre profil de restriction. Les enzymes de restriction les plus fréquemment utilisées, EcoRI ou BglII génèrent un grand nombre de petites bandes, rendant la lecture des profils de restriction difficile.

Une hybridation avec des sondes nucléiques (Southern blotting) peut être couplée avec cette technique. Après migration standardisée en gel d’agarose, les fragments générés sont transférés sur une membrane et hybridés avec une sonde marquée, sélectionnée pour reconnaître des séquences répétées en divers endroits du génome. C’est le principe du ribotypage, qui utilise une sonde spécifique du gène de l’ARN ribosomique 16S et 23S. Le

    ⁷⁰   ribotypage est une technique reproductible et rapide possédant une forte typabilité. Sa concordance épidémiologique est excellente, mais son pouvoir discriminant insuffisant (toutes les souches liées épidémiologiquement ont été regroupées, mais 7 souches non liées n’ont pu être séparées dans l’étude de Tenover en 1994) (49).

3.3.2. PFGE (pulsed-field gel electrophoresis)

Cette technique est, elle aussi, basée sur la digestion de l’ADN bactérien total par des enzymes de restriction, mais qui possèdent dans ce cas peu de sites de coupure (macro-restriction) car ils sont situés dans des séquences palindromiques. Les fragments générés, de grandes tailles (de 20 kb à plus de 1 Mb), ne peuvent être séparés par une électrophorèse en gel d’agarose conventionnelle dont l’efficacité est optimale pour des fragments de moins de 30 kb. La séparation est alors réalisée par migration en champ électrique d’orientation variable (champ pulsé). Les fragments les plus grands se réorientent plus lentement à chaque modification du champ électrique, et migrent par conséquent plus lentement. L’appartenance au même pulsotype est définie par une similarité du profil de migration supérieure à 80 % en général, complétée des critères de Tenover (51). Sa reproductibilité faible a été sensiblement améliorée par l’utilisation de logiciels d’analyse visuelle, mais l’absence de standardisation ne permet pas la portabilité des résultats. La PFGE est considérée comme le gold-standard pour le génotypage bactérien depuis les années 1980 (45).

La PFGE est, aujourd’hui encore, une des techniques de typage de S. aureus qui a le plus fort pouvoir discriminant. Elle est considérée comme le gold-standard pour l’investigation des épidémies de SARM hospitaliers. L’enzyme de restriction utilisée est SmaI. Sa typabilité est excellente, de même que sa concordance épidémiologique. Les limites de la technique sont sa lenteur d’exécution (4 à 5 jours environ), son coût élevé et une mauvaise reproductibilité inter-laboratoires, ne permettant pas la comparabilité des résultats et la constitution de bases de données internationales (24).

3.3.3. RAPD (random amplified polymorphic DNA)

La RAPD, également appelée AP-PCR (arbitrarily primed polymerase chain reaction), est basée sur l’amplification aléatoire de séquences d’ADN bactérien total à l’aide d’amorces courtes (taille inférieure à 14 pb) dans des conditions de faible stringence facilitant l’hybridation, même en cas de concordance imparfaite entre les amorces et l’ADN bactérien, et donc l’amplification. Le choix des amorces est empirique, et ne nécessite

    ⁷¹   donc aucune étude préalable du génome à typer. En résultent des fragments dont le nombre et la taille varient selon la souche. La révélation est faite par électrophorèse en gel. La méthode est simple, son spectre d’application large, sa typabilité est de 100 %, et son pouvoir discriminant est bon, même s’il est souvent considéré comme inférieur à celui de la PFGE. Son inconvénient majeur est son manque de reproductibilité, influencé par de multiples facteurs : concentration en Taq polymérase, en amorces, type de tampon, de thermocycleur, d’électrophorèse, etc. (45).

L’étude réalisée en 1995 par Tambic sur des SARM montre une bonne corrélation avec la PFGE, un pouvoir discriminant nettement supérieur à celui du lysotypage et équivalent à celui de la PFGE, ce qui n’est pas retrouvé par toutes les études (52).

3.3.4. Rep-PCR (repetitive palindromic extragenic element PCR) La rep-PCR est basée sur l’amplification de fragments d’ADN situés entre des éléments répétés, génétiquement stables, tout au long du génome et présents en un nombre variable de copies réparties de manière aléatoire dans de nombreux organismes. Si ces éléments répétés sont localisés de manière rapprochée dans le génome, ils peuvent être amplifiés par PCR au moyen d’amorces spécifiques. Plusieurs amplicons sont en général obtenus, dont la taille et le nombre varient d’une souche à l’autre, et séparés par électrophorèse. Les plus communément employés sont des éléments répétitifs palindromiques extragéniques, d’une longueur de 33 à 40 pb. Il est théoriquement possible d’obtenir une reproductibilité et une spécificité importante du fait de la longueur des amorces, mais la technique souffre en pratique des mêmes problèmes de reproductibilité que la RAPD. L’automatisation de la technique, proposée par le DiversiLab System^® de Biomérieux, devrait permettre de palier en partie ce problème en standardisant l’extraction de l’ADN, sa concentration, la microélectrophorèse, la détection et la constitution de bases de données (45).

L’étude multicentrique visant à évaluer les performances du génotypage des SARM par 3 Rep-PCR, publiée par Deplano en 2000, montre une reproductibilité de 80 %, un pouvoir discriminant de 83 % et une concordance avec la PFGE comprise entre 70 et 90 % selon les laboratoires. La reproductibilité de la technique n’était pas suffisante pour permettre des échanges de données brutes entre les différents laboratoires participants (53).

    ⁷²   3.3.5. SCCmec typing

La cassette SCCmec est l’élément génétique mobile hétérogène porteur des gènes à l’origine de la résistance à la méticilline. La variabilité de cet élément est grande, les différences de séquences observées entre les différents types pouvant atteindre 59 % (54). Les variations détectées dans les gènes de régulation de mecA (mecI et mecR1), principalement des délétions ou des insertions partielles, permettent de séparer le complexe mec en 4 classes A, B, C et D. Les gènes codant les recombinases, qui sont responsables de l’intégration et de l’excision de la cassette, forment eux le complexe ccr. Six types de ccr ont été caractérisés : ccrAB1, ccrAB2, ccrAB3, ccrAB4, ccrC1 et ccrC2. La combinaison des classes mec, des types de ccr et des jonctions J1, J2 et J3 entre ces éléments permet de définir le type de cassette SCCmec (14).

Il a été observé que les SARM responsables d’infections nosocomiales et ceux responsables d’infections communautaires (SCCmec IV) n’étaient pas porteurs des mêmes types de cassettes SCCmec (45). Ce marqueur a été utilisé dans de nombreuses études épidémiologiques portant sur les SARM et permet l’étude des liens phylogénétiques entre les souches (55). Il est considéré comme un bon outil pour l’investigation de l’épidémiologie des SARM et a gagné en importance avec l’apparition des SARM Co (24).

La structure de l’élément SCCmec peut être déterminée par différents types de PCR. Actuellement, les dernières techniques développées sont des PCR multiplexes, souvent accompagnées du séquençage du locus ccrB.

Cependant, les techniques actuelles ne permettent pas la caractérisation des 46 types et sous-types de SCCmec, ce qui nécessiterait un trop grand nombre de cibles. La détermination des SNP (single nucleotide polymorphisms) du gène mecA pourrait augmenter la résolution globale de la méthode, car différents allèles ont été identifiés dans des cassettes SCCmec identiques par ailleurs (24).

3.3.6. Séquençage du locus spa (spa-typing)

Cette technique, développée par Freney et al. en 1996, est basée sur le séquençage d’un locus unique, celui du gène codant la protéine A (spa) de S. aureus. Cette région, appelée région polymorphique X, est composée principalement de 3 à 15 répétitions d’une séquence de 24 pb dont la diversité est liée à des mutations ponctuelles, des délétions ou des duplications de répétitions. L’étude de souches de SARM a révélé que cette région est

    ⁷³   suffisamment stable pour le typage épidémiologique. La technique a été comparée au lysotypage, avec lequel elle montre une bonne concordance et une meilleure sensibilité (56).

La comparaison de cette méthode avec la PFGE et la MLST publiée par Malachowa en 2005 montre un pouvoir discriminant compris entre celui de la PFGE et celui de la MLST (57). La concordance entre ces méthodes est bonne (14). Le séquençage d’une région unique en fait une technique moins coûteuse que la MLST, mais aussi moins laborieuse et moins chronophage. Un logiciel d’exploitation des données est disponible pour l’analyse des chromatogrammes et permet la comparaison inter-laboratoires des résultats malgré l’existence de deux nomenclatures d’expression des résultats différentes, en attribuant un numéro à chaque variation du nombre ou de la séquence de chaque répétition (24).

Le spa-typing est une technique utilisable à la fois pour le suivi de l’évolution moléculaire de l’espèce et pour le suivi des épidémies hospitalières (24).

L’inconvénient de la technique est son pouvoir discriminant : sans être faible, il ne permet pas toujours de séparer deux clones différents possédant le même spa-type. Cet écueil peut néanmoins être facilement pallié par le couplage à un autre marqueur génétique, comme le typage de la cassette SCCmec (24).

3.3.7. MLST (multi-locus sequence typing)

La MLST est basée sur l’analyse par séquençage de 7 gènes de ménage conservés au sein de l’espèce S. aureus : arcC (carbamate kinase), aroE (shikimate déshydrogenase), glpF (glycerol kinase), gmk (guanylate kinase), pta (phosphate acétyltransferase), tpi (triosephosphate isomérase) et yqiL (acétyl-coenzyme A acétyltransferase). Chaque fragment mesure environ 500 pb. Un numéro d’allèle est assigné à chaque type de séquence de chaque gène de ménage. Environ 30 allèles sont décrits pour chaque gène de ménage. La composition en allèles de chaque souche, ou profil allélique, défini le sequence type (ST) de la souche. Deux isolats présentant au moins 5 allèles identiques sont considérés comme génétiquement liés et peuvent être regroupés au sein d’une unité appelée complexe clonal (CC). La nomenclature des SARM utilise généralement le ST couplé au type SCCmec pour nommer une souche (24).

Les avantages de la méthode sont un bon pouvoir discriminant et une excellente reproductibilité, rendant possible la portabilité des données par expression des résultats en

    ⁷⁴   une suite de chiffres, et la constitution de bases de données internationales. Une base de données contenant des milliers de séquences est d’ailleurs disponible sur internet (http://www.mlst.net), permettant une comparaison rapide des souches dans un contexte épidémique, mais aussi les analyses de génétique des populations et la phylogénie. Le temps nécessaire à la réalisation et à l’interprétation des données ainsi que son coût élevé représentent les principaux facteurs limitant de la MLST (58).

3.3.8. MLVA (multi-locus variable number tandem repeat analysis)

La MLVA exploite la variation de nombre de motifs répétés en tandem. Cette technique est celle utilisée en médecine légale pour la détermination des empreintes génétiques. L’amplification d’un nombre prédéfini de loci suivie de la mesure de la taille de chaque fragment permet d’assigner à chaque souche une série de nombres correspondant aux nombres de répétitions pour chaque locus. Le nombre de répétitions de chaque locus est spécifique de chaque souche (14). La révélation est possible soit par migration par électrophorèse en gel d’agarose, soit par séquençage des fragments amplifiés.

L’application de la MLVA à S. aureus a été possible après la découverte de nombreux VNTR (variable number tandem repeats) dans son génome, identifiés grâce au séquençage complet de différentes souches de S. aureus. Huit cent trente trois tandem-repeats ont été ainsi identifiés dans le génome de S. aureus, dont 8,5 % sont polymorphes (2 allèles au minimum ont été identifiés). Parmi ceux-ci, 87 % ont une longueur totale de plus de 80 pb et une conservation des unités répétées de plus de 80 %, ce qui fait de S. aureus un bon candidat pour la MLVA (59).

L’utilisation d’un schéma de MLVA a été appliquée pour la première fois au typage de S. aureus en 2002 par Sabat et al. Cinq loci de VNTR ont été utilisés, comprenant sdr, clfA, clfB, ssp et spa. Les séquences répétées comportent de 9 à 81 pb. La longueur des fragments amplifiés a été mesurée par électrophorèse en gel (figure I.8). Toutes les souches étudiées ont pu être typées. La méthode a été comparée au gold-standard, la PFGE, et a donné des résultats comparables avec une excellente reproductibilité, un fort pouvoir discriminant, au moins équivalent à celui de la PFGE ou de la RAPD (58).

    ⁷⁵   Ikawaty et al. ont montré des performances équivalentes par comparaison à la MLST et au spa-typing avec un schéma de MLVA utilisant 7 VNTR, nommés SIRUs (staphylococcal interspersed repeat units) comportant 24 à 131 pb et répétés de 1 à 26 fois. L’étude a montré un pouvoir discriminant de la MLVA (0,987) supérieur à celui de la MLST (0,941) ou du spa-typing (0,963), avec une excellente typabilité. La comparaison ultérieure de ce schéma avec la PFGE a également montré le pouvoir discriminant supérieur de la MLVA sur cette dernière (0,971 vs 0,908). Les différentes méthodes testées donnent par ailleurs des résultats globalement concordants (60).

En 2008, Pourcel et al. ont publié un schéma de MLVA comportant 10 VNTR de première intention, et 4 VNTR complémentaires. Ces VNTR appartiennent aux gènes spa, coa, à des S. aureus repeat elements (STAR) ou à des éléments intergéniques. Les unités répétées comprennent entre 24 et 159 pb. La révélation est faite par migration sur gel d’agarose. La méthode s’est avérée être parfaitement reproductible et stable après repiquage des souches, et avoir une bonne typabilité. La comparaison avec la MLST et le spa-typing a montré des résultats globalement concordants entre les techniques et un plus

Figure I.8 : Profil MLVA de 34 souches de S.

    ⁷⁶   grand pouvoir discriminant de la MLVA. L’expression des résultats en une suite de chiffres permet leur portabilité (61).

Chaque étude a mis en évidence la simplicité de la méthode, son faible coût et sa facilité d’interprétation. Sa répétabilité intra comme inter-laboratoires, permettant la constitution de bases de données internationales, associée à son fort pouvoir discriminant, font de la MLVA une des techniques de typage de S. aureus les plus réactives et performantes.

    ⁷⁷  

P

2 : T

S

AUREUS PAR TECHNIQUE MULTI

-

-

TANDEM ANALYSIS AVEC DETECTION EN HIGH RESOLUTION MELTING

1. Contexte scientifique : technologie HRM

1.1. Principe de l’HRM

La technologie de fusion haute résolution (FHR), plus communément appelée HRM pour high resolution melting, est une extension de l’analyse en courbe de fusion utilisée en PCR en temps réel depuis 1997 avec des agents marqués se liant à l’ADN double-brin de type SYBR Green I.

Son principe repose sur la détermination de la température de fusion des fragments préalablement amplifiés (figure II.1) par PCR. Cette température de fusion varie selon le nombre, le type de nucléotides et la spécificité de leur appariement.

La caractérisation des amplicons se fait par acquisition d’une courbe de fusion (figure II.2) en fin de PCR, obtenue par la mesure en continu (25 acquisitions par degré Celsius) de la fluorescence lors de l’augmentation progressive de la température de 55 °C à 95 °C par paliers de 0,01 à 0,05 °C (62).

    ⁷⁸   La dérivée première de la courbe (figure II.3) permet la visualisation d’un pic, appelé température de fusion (Tm). Le Tm est la température pour laquelle 50% de l’ADN double-brin est dénaturé. Il dépend du type et du nombre de nucléotides composant les amplicons.

High-resolution DNA melting analysis for molecular diagnostics – REVIEW

599

future science group

future science group www.futuremedicine.com

attribute of fluorescence: as the temperature is raised, fluorescence decreases. At lower temper-atures, an exponential component of back-ground becomes apparent that arises from dye binding to high concentrations of primers.

Methods to remove linear [4] and exponential [31]

background have been described and are incorporated into commercial high-resolution melting software.

The Tm of a PCR product is a convenient metric, but it is only one point on the melting curve. More information is contained in the complete melting curve than in the Tm. The shape of the melting curve is used extensively in sequence matching and mutation scanning as an indicator of heteroduplexes formed from heterozygous DNA.

Cost

Cost advantages of high-resolution melting are derived from the simplicity of the technique. The only reagent required is a saturating DNA dye that costs less than the PCR reagents/con-tainer. Available hardware ranges from real-time instruments at more than US$50,000, down to

$15,000 [3]. All instrument options cost

signifi-cantly less than a denaturing high-pressure liquid chromatography (DHPLC) setup for mutation scanning. Additional cost advantages include the time saved and errors avoided because the method is closed-tube, and the ability to perform both genotyping and scanning on one platform with one generic reagent.

W orkflo w

The saturating dye is added into the PCR before amplification, so no sample processing or addi-tions are necessary after PCR has begun. DNA extraction and quantification are usually per-formed before PCR. For best results, all test and control DNA should be prepared in the same way and added into the PCR at the same concentra-tion. However, good results can also be obtained from crude DNA preparations, such as those pre-pared from dried blood spots without quantifica-tion [32]. If care is taken to prevent undesired side reactions through PCR optimization and the reaction is run into the plateau phase for all sam-ples, the initial DNA concentration can vary between samples by at least 100-fold.

PCR optimization

Robust, specific PCR is critical when results depend on the PCR product melting profile. Use of a gradient thermal cycler and gel electro-phoresis is still one of the best methods for

opti-mization of conditions, and varying the Mg2+

concentration usually allows multiple targets to be amplified under identical conditions.

Genotyping

Although there are many methods of genotyping, closed-tube methods have strong advantages for the clinical laboratory, point-of-care diagnostics and personalized medicine. Since no processing is required between amplification and analysis, the need for automation and risk of contamination are eliminated. These methods conventionally use allele-specific labeled probes, often a fluorescent dye and a quencher that separate during amplifi-cation by hydrolysis and/or loss of secondary

structure [28]. In order to genotype correctly, two

probes, one matching the wild-type sequence and

Figure 1. Fluorescent DNA melting analysis.

(A) Original fluorescence data showing a linear decrease of fluorescence at low temperature, followed by a rapid decrease centered around the melting temperature (Tm). Fluorescence is low when the DNA is single stranded. (B) The original data is normalized between 0 and 100% after background subtraction so that the curve is horizontal outside of the transition.

Fluorescence 600 400 200 0 Temperature (°C) 76 79 82 85 88 91 Temperature (°C) 76 79 82 ^Tm85 88 91 Tm 0 25 50 75 100 Fluorescence (normaliz ed) Original data

Normalized melting curve B

A

Double-stranded

DNA ^{Single-stranded}

DNA (random coils)

Single-stranded DNA (random coils) Double-stranded

DNA

Figure II.2 : Courbe de fusion

Figure II.3 : Pics de fusion

    ⁷⁹   Des changements minimes de fluorescence doivent pouvoir être observés lors de l’acquisition des courbes de fusion afin de permettre une détermination fine et précise du Tm. Pour cela, la résolution de la courbe de fusion a été optimisée par l’utilisation d’une instrumentation spécifique et de réactions de PCR adaptées (63).

1.2. Avantages de l’HRM

L’acquisition d’une courbe de fusion haute résolution se fait dans le même capillaire que celui utilisé pour l’amplification, généralement sur le thermocycleur ayant réalisé la réaction de PCR, et dans les suites immédiates de la PCR. La durée d’acquisition est environ de deux minutes par capillaire.

Elle ne nécessite donc aucune étape de manipulation ou de traitement post-PCR, ce qui en fait une technique beaucoup plus rapide et simple que les autres méthodes de détection utilisées pour le typage moléculaire. De plus, l’analyse en système clos diminue très fortement le risque de contaminations.

Aucun équipement spécifique n’est requis, si ce n’est un thermocycleur possédant la fonction d’acquisition de la fusion haute résolution, et dont le coût est modéré en regard des méthodes de référence (PFGE, séquençage, etc.).

Cette technique présente donc de nombreux avantages pratiques : rapidité, faible coût, accessibilité. De plus, l’HRM est une méthode non spécifique de détection des mutations,