2.2.1 Culture cellulaire
Les cellules embryonnaires humaines de rein HEK 293 exprimant le récepteur h AT] de façon stable a été obtenue du laboratoire du Dr Guillemette. Cette lignée cellulaire est maintenue en culture dans un milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 100 U/ml de Pénicilline, 100 pg/ml de Streptomycine, 0.25 pg/ml Amphotericin B (PSA) ainsi que de 50 mg/ml de G418 pour assurer une sélection continuelle des cellules exprimant le récepteur. Les cellules HEK 293 sont incubées à 37°C dans une atmosphère de 5% de CO2. Les cellules
sont passées régulièrement lorsqu’elles atteignent une confluence maximale, soit de façon générale à tous les 3 à 4 jours.
2.2.2 Radioiodination du [Sar1, Ile8] Ang II
La réaction de radio iodation se fait dans des tubes Eppendorf dont les parois sont préalablement recouvertes de l’agent oxydant IODO-GEN (20.0 pg, 4.6 mol) tel que rapporté par Fraker et al., 1978. Dans l’ordre: 70 pi d ’HiO, 10 pl d ’acide acétique 2M, 10 pl du peptide [Sar1, Ile8] Ang II 10 mM et 10 pl de Na 125I ImCi sont ajoutés. La réaction se fait à température ambiante pour une durée de 15 minutes. 10 pl de NanSCE est ajouté à la fin de l’incubation. Le peptide est ensuite purifié par HPLC sur une colonne C18 avec un gradient de 20-40% d ’acétonitrile dans 0.05% d ’acide trifluoroacétique aqueux.
2.2.3 Préparation de membranes et études de liaison
Des boîtes de Pétri de cellules HEK 293 à confluence maximale exprimant le récepteur h ATi de façon stable sont congelées à -80°C pour une période de temps minimale de 24 heures. Ces boîtes de Pétri (préalablement congelées) sont ensuite incubées à 37 °C pendant 1 minute pour produire un choc thermique afin de briser les cellules. 10 ml de tampon de lavage (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, et 5 mM M gCh) est ajouté. Les cellules sont doucement
décollées à l’aide d ’un grattoir de cellules et celles-ci sont ensuite centrifugées à 4000 rpm pendant 15 minutes à une température de 4°C. Le culot est resuspendu dans 10 ml de tampon de liaison (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 5 mM M gCh, and 0.1% (p/v) BSA). Pour effectuer des études de liaison, une concentration croissante du ligand à tester (15 points de concentrations en duplicata de 10'12 M à 10'5 M incluant les demi-log) est ajoutée aux suspensions de membranes homogénéisées ainsi que O.lnM de 123I-[S ar\ Ile8] Ang II (1500 ±500 Ci/mmol). Le tout est incubé à la température de la pièce pour une période de 60 minutes. La radioactivité libre est filtrée à travers des filtres GF/C préalablement trempés dans le tampon de liaison. Finalement, la radioactivité liée au récepteur est comptée par un compteur y (WIZARD). Les courbes concentration-réponse tracées et analysées par le programme GraphPad Prism 5.00.
2.2.4 Dosage de l’inositol monophosphate par FRET:
Des boîtes de Pétri de cellules HEK 293 h ATi stables sont préparées à raison de 5 millions de cellules/boîte de Pétri environ 24 heures avant la journée de l ’expérience. Les cellules doivent être à une confluence de 70-80%. Pour effectuer le dosage d ’inositol phosphate, les cellules sont lavées avec 10 ml de tampon phosphate (0.15 MNaCl,3 mM KC1, 8 mM Na2HPC>4, 2 mM
KH2PO4, pH=7.4), 1.5 ml de trypsine/EDTA est ajouté et les cellules sont incubées à 37 °C
pendant 5 minutes. Les cellules sont resuspendues dans 15 ml de DMEM complet et triturées 5 fois pour bien séparer les cellules les unes des autres. Ix s cellules sont centrifugées à 700g pendant 5 minutes. Le culot est resuspendu dans 1 ml de tampon de stimulation (HEPES 10 mM, CaCb 1 mM, MgCl2 0.5 mM, KC1 4.2 mM, NaCl 146 mM, glucose 5.5 mM et LiCl 50 mM, pH=7.4). Les ligands sont également dilués dans le tampon de stimulation. Les concentrations données ici sont pour une plaque de 96 puits : les cellules (1000 cellules/pl) et les ligands à volumes égaux doivent représenter chacun 35% du volume total. Pour un volume total de 100 pl, 35 pl de cellules et 35 pl de ligands sont ajoutés. Pour mesurer le signal basai, 35 pl de cellules avec 35 pl de tampon de stimulation sont ajoutés dans un puits. Après avoir bien agité la plaque, celle-ci est incubée à 37 °C dans l’incubateur à cellules en présence de 5% de CO2 pendant 30 minutes. Ensuite, les réactifs suivants sont ajoutés dans l’ordre à
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(anticorps monoclonal spécifique à FIPi marqué au terbium cryptate). Les plaques sont incubées pendant 60 minutes à température ambiante et sous légère agitation (100 rpm). L’IPl-d2 et l’IPi entrent en compétition pour l ’AB-Cryp. Le signal FRET est produit uniquement quand l’AB-Cryp lie l ’IP l-d2 et il est ainsi inversement proportionnelle à la relâche d ’IPi cellulaire. Ce signal FRET est lu à l ’aide d ’un appareil TECAN M1000 (donneur: excitation à 337nm et émission à 620nm, accepteur : excitation à 337nm et émission à 665nm). Les résultats sont calculés à partir des ratios de fluorescence 665nm/620nm et les données sont analysées par le programme de GraphPad Prism 5.00. La réponse maximale de FRET générée par l'Ang II a été fixée à 100% et la réponse obtenue par tous les autres ligands a été normalisée par rapport à cette valeur.
2.2.4 Dosage du recrutement de la p-arrestine 2 par BRET
Au jour 1, un passage cellulaire 2/8 de cellules HEK293 dans des boîtes de Pétri 10 cm est effectué (Les cellules à confluence sont resuspendues dans 8 ml de milieu DMEM complet et 2 ml de cette suspension cellulaire est transférée dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm complétée à 10 ml avec du milieu DMEM complet). Au jour 2, la transfection des cellules est effectuée selon la procédure suivante : les complexes d ’ADN sont préparés pour chaque boîte de Pétri à raison de 600 pl de milieu OPTI-Mem, 8.4 pg du plasmide h ATi-GFP10, 600 ng de (3-arrestin2-Rluc et 27 pl de polyethylenimine (PEI). Après une période de 15 minutes, la totalité des complexes est ajoutée aux boîtes de Pétri de cellules HEK 293 préalablement préparées la veille. Au jour 3, les cellules sont stimulées par les différents analogues à l’étude. Les dilutions de ligands sont préparées dans du tampon HBSS à raison de 8 points allant de 1x10 5 à 1x10 12 M dans le volume final. Le milieu des boîtes de Pétri de cellules HEK293 transfectées est aspiré et les cellules sont lavées avec 6 ml de tampon PBS. Les cellules en suspension sont mises dans 5.5 ml de tampon HBSS et les cellules sont décollées avec soin à l’aide d ’une pipette plOOO. Les cellules remises en suspension sont ensuite distribuées dans une microplaque blanche à 96 puits à raison de 80 pl de cellules et 10 pl de ligands aux différentes concentrations pour les courbes concentration-réponse. Les plaques sont incubées à 37°C dans l’incubateur à cellules en présence de 5% de CO2 pendant 10 minutes. Ce temps de
P-arrestine 2 au récepteur h ATi qui montrait que la réponse BRET atteignait un plateau après environ 10 minutes (figure 18). 10pl de DeepBlueC coelentérazine sont ajoutés immédiatement avant la lecture (concentration finale de 5 pM). Le signal BRET est lu à l’aide d ’un appareil TECAN M l000 et les données sont analysées par le programme de GraphPad Prism 5.00. Le signal BRET est produit quand la P-arrestin2-Rluc se trouve à une distance proximale du récepteur h ATi-GFP10 permettant une interaction biomoléculaire avec celui-ci. Le signal de BRET a été déterminé par le calcul du rapport de la lumière émise par le récepteur-GFPlO (515nm) par rapport à la lumière émise par la P-arrestine-2-Rluc (410nm). La réponse maximale de BRET générée par l'Ang II a été fixée à 100% et la réponse médiée par tous les autres ligands a été normalisée par rapport à cette valeur.
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