III. Méthodes de dosage pour les biomarqueurs du bilan lipidique
4. Méthodes de dosage des triglycérides
La mesure de la concentration en triglycérides dans le sérum est un paramètre important afin d’évaluer le risque de développer des maladies cardiovasculaires. En effet, les triglycérides représentent un facteur de risque indépendant dans le développement de l’athérosclérose ainsi qu’une cible thérapeutique chez les patients hypertriglycéridémiques. Leur concentration est également corrélée à une concentration accrue en LDL de faible taille pour lesquelles l’athérogénéicité est la plus importante [160].
De plus, les triglycérides sont un des quatre paramètres du bilan lipidique et entrent en jeu dans la détermination de la concentration en LDL-cholestérol par l’équation de Friedewald.
Il est donc fondamental de disposer de mesures fiables de ce paramètre afin de dépister efficacement une hypertriglycéridémie et de déterminer précisément la concentration en LDL- cholestérol. Pour ce faire, le NCEP a fixé un biais maximum de 5% et un coefficient de variation inférieur ou égal à 5 % afin de disposer de valeurs les plus fiables possibles [125, 126].
4.1. Méthodes de dosage utilisées par les laboratoires de biologie médicale
Actuellement, les laboratoires de biologie médicale utilisent trois méthodes pour doser les triglycérides : le dosage enzymatique du glycérol total par spectrophotométrie avec et sans correction du glycérol libre ainsi que le dosage enzymatique du glycérol total par spectroréflectrométrie. Le principe général de ces méthodes est basé sur l’hydrolyse des triglycérides par des enzymes spécifiques : les lipases (Figure 27). Le glycérol alors libéré est ensuite phosphorylé par une glycérolkinase afin de former du glycérol-3-phosphate puis oxydé par une glycérol-3-phosphatase oxydase. Le peroxyde d’hydrogène formé réagit avec un chromogène phénolique et entraîne une coloration rouge de la solution dont l’intensité est directement proportionnelle à la concentration en glycérol total.
Figure 27 : Principe de la méthode enzymatique de dosage des triglycérides.
Les triglycérides sont hydrolysées par une lipoprotéine lipase et le glycérol ainsi libéré est dosé par colorimétrie après réaction avec une glycérokinase ainsi qu’une glycérol-3-phosphate [161].
Triglycéride + H2O
Dihydroxyacétone + H2O2
Coloration
Glycérol + acides gras
Glycérol-3-Phosphate Oxydase POD H2O2 + 4-aminophénazone acide + 3,5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonique Lipoprotéine Lipase
Glycérol + ATP Glycérol-3-Phosphate + ADP
Glycérol-3-Phosphate + O2
Glycérokinase
Triglycéride + H2O
Dihydroxyacétone + H2O2
Coloration
Glycérol + acides gras
Glycérol-3-Phosphate Oxydase POD H2O2 + 4-aminophénazone acide + 3,5-dichloro-2-hydroxybenzène sulfonique Lipoprotéine Lipase
Glycérol + ATP Glycérol-3-Phosphate + ADP
Glycérol-3-Phosphate + O2
Il est important de noter qu’en moyenne 5 à 10 % du glycérol est présent dans le sérum sous forme libre [162]. Afin de tenir compte uniquement du glycérol présent au sein des mono, di et triglycérides une méthode de dosage utilisant une correction du glycérol libre a été mise en place par Beckman Coulter. Le principe de cette dernière consiste à doser le glycérol présent dans l’échantillon avant la cascade enzymatique détaillée ci-dessus. La concentration obtenue est alors soustraite à celle obtenue après hydrolyse des triglycérides afin de déterminer la concentration en glycérol total dite « corrigée ».
Plus de 85 % des laboratoires utilisent la technique dosant le glycérol total par spectrophotométrie tandis que 13 % des laboratoires utilisent la mesure spectroréflectométrique dont le principe est développé dans le Chapitre III.1.1. Seulement 1 % des laboratoires utilisent la méthode de dosage du glycérol total « avec correction ».
4.2. Méthodes de référence
Il existe actuellement deux méthodes de référence répertoriées par le JCTLM pour le dosage des triglycérides dans le sérum. Ces méthodes sont toutes les deux basées sur le principe de la ID- GC/MS appliquée au dosage du glycérol total. Les étapes de préparation des échantillons ainsi que les conditions d’hydrolyse des triglycérides sont similaires. Les principales différences entre ces deux méthodes se font au niveau des étapes d’extraction et de dérivation du glycérol. En effet, la dérivation dans le protocole d’Ellerbe et collaborateurs [163] se déroule en deux étapes tandis que celle d’Edwards et collaborateurs [164] est réalisée en une seule réaction (Figure 28).
La méthode de référence développée par le NIST [163] se divise en quatre étapes : l’hydrolyse des glycérides, l’extraction en phase solide du glycérol, la dérivation du glycérol et enfin l’analyse par GC/MS. Les étalons ainsi que les échantillons sont hydrolysés par une solution de KOH alcoolique à 0,05 mol/L pendant 2h30 à 70°C. L’hydrolysat subit ensuite une extraction en phase solide à l’aide d’une résine échangeuse d’ions puis le glycérol est dérivé par un mélange d’acide butylboronique/pyridine puis avec une solution de MSTFA avant d’être analysé par GC/MS.
La seconde méthode de référence utilisée par le CDC [164] comprend également quatre étapes qui sont l’hydrolyse des glycérides, la dérivation du glycérol, l’extraction du glycérol dérivé et enfin l’analyse par GC/MS, mais leur ordre est différent de celle développée par le NIST. Les étalons et les échantillons sont hydrolysés avec une solution d’hydroxyde de potassium alcoolique à 0,3 mol/L pendant 2h30 à 80°C afin de libérer tout le glycérol contenu dans les échantillons. L’hydrolysat est évaporé puis dérivé par un mélange anhydride acétique/pyridine (1/3 ; V/V) pendant 1 heure à 65°C afin de former du triacétate de glycérine. Le glycérol dérivé subit ensuite
une extraction liquide-liquide avec un mélange d’acétate d’éthyle/eau (2/3 ; V/V). Pour finir, la phase organique est lavée au bicarbonate de sodium (8 %) afin d’éliminer l’acide acétique formé lors de l’étape de dérivation, puis l’échantillon est analysé en GC/MS.
Figure 28 : Principe des 2 méthodes de référence répertoriées par le JCTLM pour le dosage des triglycérides.
La préparation des échantillons et l’hydrolyse sont similaires entre les deux méthodes mais l’ordre des étapes d’extraction et de dérivation réalisées avant l’analyse par GC/MS est inversée.
Préparation des échantillons
Q = Quantité d’étalon primaire / Quantité de composé marqué≈ 1
Hydrolyse des triglycérides
KOH Alcoolique Libération du glycérol
Dérivation du glycérol
Anhydride acétique/Pyridine
Extraction du glycérol acétate
Acétate d’éthyle et eau dé-ionisée
ANALYSE EN CHROMATOGRAPHIE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE Extraction phase solide du glycérol
Résine échangeuse d’ions
Double dérivation du glycérol
-Acide butylboronique/Pyridine -MSTFA
S. H. Edwards, Clin Chem 2012 [145] P. Ellerbe, Clin Chem 1995 [144]
Préparation des échantillons
Q = Quantité d’étalon primaire / Quantité de composé marqué≈ 1
Préparation des échantillons
Q = Quantité d’étalon primaire / Quantité de composé marqué≈ 1
Hydrolyse des triglycérides
KOH Alcoolique Libération du glycérol
Hydrolyse des triglycérides
KOH Alcoolique Libération du glycérol Dérivation du glycérol Anhydride acétique/Pyridine Dérivation du glycérol Anhydride acétique/Pyridine
Extraction du glycérol acétate
Acétate d’éthyle et eau dé-ionisée
Extraction du glycérol acétate
Acétate d’éthyle et eau dé-ionisée
ANALYSE EN CHROMATOGRAPHIE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE ANALYSE EN CHROMATOGRAPHIE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE Extraction phase solide du glycérol
Résine échangeuse d’ions
Extraction phase solide du glycérol
Résine échangeuse d’ions
Double dérivation du glycérol
-Acide butylboronique/Pyridine -MSTFA
Double dérivation du glycérol
-Acide butylboronique/Pyridine -MSTFA
S. H. Edwards, Clin Chem 2012 [145] P. Ellerbe, Clin Chem 1995 [144]