Méthodes de dosage

Les études cinétiques sont menées avec des rats préalablement cathétérisés. Le jour de l’expérimentation, l’animal est placé dans une boite de contention. Les prélèvements de sang d’un volume d’environ 100 4L sont :

- Soit immédiatement congelés puis transportés à l’Institut pour analyse (éthanol et GHB) ;

- Soit centrifugés. Le sérums recueillis sont immédiatement congelés puis transportés à l’Hôpital Saint-Louis pour analyse (acides organiques).

Les dosages sont menés sur des échantillons décongelés et ramenés à température ambiante.

3.5.1 Dosage de l’éthanol

3.5.1.1 CPG/DIF

La détermination de l'éthanolémie est adaptée de la « ME083 Dosage d'alcools et de l'acétone par CG/DIF » (Roussel et coll., 2008), inscrite au plan Qualité de l'IRCGN et faisant partie des méthodes pour lesquelles l'IRCGN est accrédité par le COFRAC. La méthode a été validée selon les règles en vigueur : son domaine d’exactitude s’étend de 0,2 à 4,0 g.L-1, la limite inférieure de détection est de 0,07 g.L-1 et l’incertitude de mesure est inférieure à 10 %.

Pour cette étude et en raison du plus faible volume de sang chez le rat, la prise d'essai a été réduite à 10 µL (originellement dans la ME083, la prise d'essai est de 100 µL). La prise d'essai est diluée au 10ème dans la solution aqueuse de tert-butanol. 2 µ L de la solution obtenue sont injectés et élués au travers de la colonne HP BLOOD-ALCOHOL. L'éthanol est détecté par ionisation de flamme. L'éthanolémie est déterminée en fonction du rapport du

signal de l'éthanol à celui du tert-butanol avec une gamme d'étalonnage externe. Lors de la série d'essais, deux solutions sanguines de contrôle sont analysées.

Pour les échantillons présentant des concentrations inférieures à la limite inférieure de quantification, dans la mesure du réalisable, des dilutions au demi ou au cinquième sont analysées à la place de celles au dixième.

Cette technique a été mise en œuvre jusqu’à la panne définitive du chromatographe 5890.

3.5.1.2 ET/CPG/DIF

La détermination de l'éthanolémie est adaptée de la « ME359 Dosage d'alcools et de l'acétone par ET/CG/DIF », inscrite au plan Qualité de l'IRCGN et faisant partie des méthodes pour lesquelles l'IRCGN est accrédité par le COFRAC. La méthode a été validée selon les règles en vigueur : son domaine d’exactitude s’étend de 0,17 à 5,0 g.L-1, la limite inférieure de détection est de 0,06 g.L-1 et l’incertitude de mesure est inférieure à 12 %.

Pour cette étude et en raison du plus faible volume de sang chez le rat, la prise d'essai a été réduite à 25 µL (originellement dans la ME359, la prise d'essai est de 50 µL). La prise d'essai est diluée dans 300 µ L de la solution aqueuse de tert-butanol et 1,25 mL de chlorure de sodium cristallin. Les flacons sont agités et chauffés à 85°C pendant 30 minutes, 1 mL de l’espace de tête est injecté et élué au travers de la colonne HP BLOOD-ALCOHOL. L'éthanol est détecté par ionisation de flamme. L'éthanolémie est déterminée en fonction du rapport du signal de l'éthanol à celui du tert-butanol avec une gamme d'étalonnage externe. Lors de la série d'essais, deux solutions sanguines de contrôle sont analysées.

Pour les échantillons présentant des concentrations inférieures à la limite inférieure de quantification, dans la mesure du réalisable, la prise d’essai est ramenée à 50 µ L.

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3.5.2 Dosage du GHB par CPG/SM/SM

Le dosage du GHB sanguin a été adapté de la « ME243 Recherche et dosage de l’acide 2- hydroxybutyrique dans les urines par CPG-SM », inscrite au plan Qualité de l'IRCGN. Les différences consistent au ratio du split : 50 au lieu de 5 précédemment, et à l’acquisition en mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) en lieu et place du mode SIM (Single Ion Monitoring). La nouvelle méthode a été validée selon les règles en vigueur : son domaine d’exactitude s’étend de 2 à 500 mg.L-1, la limite inférieure de détection est de 0,6 mg.L-1 et l’incertitude de mesure est inférieure à 15 %.

La prise d’essai de 40 µ L de sang est diluée et clarifiée par 80 µ L d’acétonitrile. Après centrifugation 50 µ L du surnageant sont dilués au demi dans la solution d’étalonnage interne (GHB-D6). Le mélange obtenu est évaporé à sec, repris et dérivé par le BSTFA à 1% de

TMCS (20 minutes à 80°C). Un microlitre de la solution est analysé après une injection en split au 50ème. Le GHB-TMS et son analogue hexadeutéré sont identifiés en mode MRM avec les transitions suivantes :

Tableau 9 : Paramètres d'acquisition du mode MRM

Ion sélectionné par le 1er quadripôle Ion sélectionné par le 3ème quadripôle Energie de collision Temps d’acquisition (s) (+) 233.0 (+) 73.0 45.0 V 0.040 (+) 233.0 (+) 147.0 30.0 V 0.040 (+) 233.0 (+) 233.0 30.0 V 0.040 (+) 239.0 (+) 147.0 40.0 V 0.040 (+) 239.0 (+) 239.0 40.0 V 0.040

Le GHB sanguin est déterminé en fonction du rapport du signal du GHB-TMS à celui du GHB-D6-TMS avec une gamme d'étalonnage externe. Lors de la série d'essais, deux solutions

3.5.3 Dosage des acides organiques

Dans un tube Eppendorf, 100 µL de sérum (échantillon, points de gamme et contrôles) sont précipités par 200 µ L d’acétonitrile contenant 20 mg.L-1 de formiate (étalon interne). Après agitation et centrifugation (14000 tours.min-1 pendant 5 minutes), le surnageant est décanté puis évaporé à sec dans un tube borosilicaté à température ambiante. Le résidu sec est repris par 100 µ L de tampon de séparation. Les solutions obtenues sont introduites dans le capillaire en mode hydrodynamique sous un temps variable (2 à 8 s). La séparation se fait selon le principe de l’électrophorèse de zone dans un capillaire de silice (75 µm de diamètre x 50 cm de longueur effective) dynamiquement recouvert d’une couche polycationique (dynamic coating) avant l’analyse de chaque échantillon, de façon à inverser le flux électro-osmotique. La séparation est réalisée sous un voltage de 30 kV, en polarité inverse à une température de 25°C. Les acides organiques sont détectés en mode ultraviolet indirect à 254 nm. Dans ces conditions de séparation, les temps de migration et les mobilités apparentes sont respectivement pour :

- les formiates 3,60 min et µe = -0,00053592 m2V-1s-1 ;

- les acétates 4,78 min et µe = -0,00039133 m2V-1s-1 ;

- les acéto-acétates 4,88 min et µe = -0,00038227 m2V-1s-1 ;

- les lactates 4,94 min et µe = -0,00037622 m2V-1s-1.

Pour tous les acides, la méthode est linéaire de 15 à 4000 mg.L-1 correspondant à une linéarité de :

- 0,25 à 67,8 mmol.L-1 pour les acétates ;

- 0,15 à 39,2 mmol.L-1 pour les acéto-acétates ;

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Les limites de détection et de quantifications sont respectivement de 5 et 15 mg.L-1 (sous une injection de 8 s), soit :

- 0,08 et 0,25 mmol.L-1 pour les acétates ;

- 0,05 et 0,15 mmol.L-1 pour les acéto-acétates ;

- 0,06 et 0,17 mmol.L-1 pour les lactates.

Pour les trois acides, les coefficients de variation de l’exactitude sont inférieurs à 11 %. Il n’y a pas d’interférence avec l’héparine, ni avec différents anions inorganiques physiologiques, soit parce qu’ils sont rapidement élués (chlorures : 2,66 min), soit car ils ne sont pas détectées aux concentrations physiologiques (sulfates, phosphates, nitrates).