Méthodes de quantification en microscopie

4.6.1. Quantification en microscopie visible : noyaux BrdU+ et cellules Arc+

La quantification des noyaux ou cellules immunomarqués est réalisée sur un échantillon stéréologique d’une coupe sur six (espacées de 180µm) au niveau du gyrus denté des deux hippocampes dorsaux. Les noyaux ou cellules immunopositifs sont comptés sous microscope en utilisant l’objectif x40. Pour chaque coupe, la surface des deux gyri dentés droit et gauche est délimitée à l’aide du logiciel Mercator (ExploraNova) sous objectif x10 grâce aux repères anatomiques fournis par la contre-coloration nucléaire au Nuclear Fast Red et par l’atlas de cerveau de souris (Mouse atlas brain, Franklin et Paxinos) (Figure 8).

La densité de cellules par surface de tissu est obtenue en divisant le nombre total de cellules comptées par la somme des surfaces des hippocampes échantillonnés. Le volume de référence (« Vref ») du gyrus denté est calculé en multipliant la somme des surfaces des coupes échantillonnées par la distance entre deux coupes (soit 180µm pour un échantillonnage de 1 coupe sur 6 ; ou 360µm pour un échantillonnage de 1 coupe sur 12). Avant chaque interprétation, les Vrefs de chaque groupe d’animaux sont comparés afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence significative entre eux (Gundersen, 1980; Gundersen and Osterby, 1981; West et al., 1991).

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Figure 8. Photographie d’une section frontale contre-colorée au Nucléar fast Red illustrant la présence de cellules immunopositives au BrdU (flèches) dans le gyrus denté. La surface du gyrus denté est mesurée grâce au tracé du contour du gyrus réalisé avec le logiciel Mercator (Explora Nova) (CCG : Couche de Cellules Granulaires, ZSG : Zone Sous Granulaire).

Quantification des cellules Arc+

La méthode de quantification des cellules Arc+ est la même que celle des noyaux BrdU+, à la différence que l’analyse est réalisée sur un échantillon stéréologique d’une coupe sur douze (espacées de 360µm) au niveau des gyri dentés des deux hippocampes dorsaux. Le volume de référence (Vref) est donc cette fois calculé en multipliant la somme des surfaces échantillonnées par la distance entre deux coupes de 360µm.

4.6.2. Quantification de la densité du marquage NPY et CB

Ces deux protéines sont exprimées par les cellules granulaires du gyrus denté et/ou les interneurones GABAergiques de l’hippocampe. Le marquage étant localisé sur les axones et dendrites, les marquages du Neuropeptide Y (NPY) et de la calbindine (CB) ont été quantifiés par la mesure de densité optique dans l’hippocampe dorsal. L’analyse a été effectuée sur deux coupes coronales de cerveau espacées de 360µm, selon la méthode décrite par Palop et al. (2011). Les images sont obtenues grâce à une caméra numérique (Optronics, Goleta, CA) connectée à un microscope optique (objectif x10, BX51 Olympus) en utilisant le logiciel Mercator (Explora Nova, La Rochelle, France). À chaque pixel correspond un nombre compris entre 0 (noir) et 255 (blanc), qui représente l’intensité de la lumière transmise en un point. Les images sont traitées pour avoir une coloration 8-bits (noir et blanc) et en mode négatif (inversion). Ainsi les zones les plus claires sont celles qui correspondent au marquage le plus important. Les intensités de marquage sont mesurées par un logiciel d’analyse d’image ImageJ (logiciel libre d’accès, disponible sur http://rsb.info.nih.gov.gate1.inist.fr/ij/) et sont exprimées en densité optique intégrée (IOD). Les IOD obtenues correspondent à la moyenne de deux aires de mesures, pour chaque gyrus denté.

Pour le marquage NPY, les IOD sont mesurées dans la couche moléculaire (axones des interneurones), les fibres moussues (axones des cellules granulaires) et le thalamus qui sert de zone contrôle. Pour le marquage de la Calbindine, les IOD sont mesurées dans la couche moléculaire (dendrites des cellules granulaires) et le stratum radiatum (SR) de la région CA1 (Figure 9). Les zones contrôles où le marquage étudié est stable sont utilisées pour normaliser les IOD de chaque gyrus denté afin de tenir compte des variations d’intensité du signal entre les coupes. Enfin, pour chaque groupe de souris, la densité optique a été normalisée par rapport au groupe contrôle, dont la moyenne est arbitrairement fixée à 1.

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Figure 9. Schéma d’une coupe frontale de cerveau (adapté d’après « Mouse Atlas Brain » de Franklin et Paxinos). DG: gyrus denté, MoDG: couche moléculaire du DG, GrDG: couche granulaire du DG, CA1/3: Corne d’Ammon1/3, SLu: Stratum lucidum, Py : couche de cellules pyramidales, LPLR et LPMR: noyau thalamique latéral postérieur (médio et latéro-rostral)

4.6.3. Analyse phénotypique des cellules BrdU+

L’étude de co-localisation intracellulaire du BrdU avec les marqueurs NeuN et DCX a été menée en microscopie confocale avec un laser krypton/argon 488/568 (Leica Sp2, plateforme RIO, IFR109-CBD) qui permet de s’assurer rigoureusement de la colocalisation tridimensionnelle des trois marqueurs d’intérêt, non seulement dans les dimensions x et y, mais aussi dans l’épaisseur de la coupe (dimension z).

De manière générale, le pourcentage de co-localisation des marqueurs dans les cellules est déterminé en analysant 20 cellules immunopositives au BrdU (BrdU+) par animal, puis en estimant parmi celles-ci, la proportion doublement marquée (BrdU+NeuN+ ou BrdU+DCX+). Au microscope confocal, la colocalisation est déterminée en scannant séquentiellement les trois fluorochromes afin d’éviter le chevauchement des signaux émis dans le vert, le rouge et dans le rouge lointain, puis en superposant les images obtenues pour examiner leur colocalisation dans les trois plans de l’espace.

4.6.4. Analyse morphologique des nouveaux neurones GFP+

La maturation morphologique des nouveaux neurones se poursuit dans les jours suivant leur naissance au sein du gyrus denté (Zhao et al., 2006). Notamment, il a été montré qu’après avoir migré localement dans la couche granulaire et après avoir émis un axone et des dendrites, les nouveaux neurones vont adopter une morphologie complexe, visible au niveau de leur arborisation dendritique et

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de la densité des épines dendritiques (Figure 10). Il est probable que cette morphologie reflète en partie le niveau d’intégration fonctionnelle de la cellule (Tronel et al, 2010). Nous avons donc envisagé d’évaluer l’état de maturation morphologique des nouveaux neurones âgés de 14 et 28 jours chez les souris Tg2576 âgées de 3 mois grâce à l’expression de la GFP. Après immunohistochimie de la GFP, plusieurs paramètres permettant d’évaluer le degré de maturation morphologique des cellules ont été mesurés à l’aide de microscopes à fluorescence (BX51 Olympus, Essex, UK) et confocal (Leica sp2, plateforme RIO, IFR109-CBD) tels que : le nombre d’embranchements dendritiques, la densité des épines dendritiques, la longueur des dendrites ainsi que la présence d’axones de projection vers la région CA3 (Figure10D).

Figure 10. Photographies en microscopie à fluorescence montrant en rouge (Alexa 555) les nouveaux neurones âgés de 28 jours transduits avec le vecteur viral-GFP dans le gyrus denté. A, gyrus denté et région CA3 de l’hippocampe. B, détails des prolongements axonaux des nouveaux neurones granulaires arrivant dans la région CA3, zone de contact avec les cellules pyramidales. C, une cellule de 28 jours transfectée avec le virus GFP. D, paramètres de l’analyse morphologique d’un nouveau neurone exprimant GFP. Barre d’échelle 500μm (A), 100μm (B), 50μm (C).