Méthodes de détection rapides de L monocytogenes

L. monocytogenes est une bactérie possédant des déterminants moléculaires de la virulence et des mécanismes d’action impliquées dans sa capacité à infecter une cellule. Étant donné ces différentes aptitudes, cette bactérie est l’un des modèles d’interaction agent pathogène/hôte au niveau cellulaire et moléculaire les plus important en recherche (Lopez, 2008). Ces aptitudes ont également permis le développement de nombreux tests de détection rapides pour L. monocytogenes (Beauchamp, 2012a; Bouguelia, 2012).

2.4.1. Méthode moléculaire

Du point de vue moléculaire, les souches de L. monocytogenes sont caractérisées par un polymorphisme génétique qui cependant n’assure pas l’existence de souches non pathogènes de L. monocytogenes. Néanmoins, les ressources moléculaires pour L. monocytogenes permettent d’identifier chaque souche grâce

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à l’utilisation de différents niveaux de typage. Ces différents niveaux de typage sont le sérotypage, la lysotypie, le typage par électrophorèse des fragments issu de l’utilisation d’enzyme de restriction de l’ADN ou par électrophorèse en champ pulsé [PFGE]) et le typage par séquençage d’acides nucléiques et par amplification aléatoire de séquences d’ADN (RAPD, Random Amplification of Polymorphic DNA). De plus, l’utilisation du dépistage moléculaire pour L. monocytogenes est une alternative de détection avantageuse puisqu’il existe des gènes tels que le gène prfA permettant la transcription d’un îlot de pathogénicité de la bactérie composé de plusieurs autres gènes de virulence détectable eux aussi individuellement (Figure 3) (Lopez, 2008). Parmi ces gènes contenus dans l’îlot de pathogénicité sont les gènes de virulence hly qui code pour la listériolysine importante pour la survie de la bactérie dans les cellules phagocytaires ; le gène mpl qui code pour une métalloprotéase zinc-dépendante permettant la maturation de la phosphatidyl-choline phospholipase C et le gène actA qui code pour la protéine ActA nécessaire au déplacement de la bactérie dans la cellule par la polymérisation de l’actine (Vazquez-Boland et al., 2001). Il existe également d’autres gènes en dehors de cet îlot de pathogénicité comme le gène iap (invasion associated protein) et les gènes internalines (inlA et inlB) qui sont importants pour l’invasion des cellules par L. monocytogenes (Beauchamp, 2012; Faith et al., 2007). Ces deux gènes peuvent être des cibles plus avantageuses que l’îlot de pathogénicité puisque le gène prfA est inhibé à basse température alors que ces deux autres ne le sont pas. Néanmoins, parmi ces deux groupes de gènes, les internalines sont les plus sensibles et les plus utilisées pour une détection rapide de colonies présomptives de L. monocytogenes sur des géloses différentielles (Lopez, 2008).

Le principal inconvénient du dépistage moléculaire de L. monocytogenes est la différenciation de l’ADN des cellules mortes et vivantes puisque c’est la présence de la bactérie vivante qui est la cause de l’infection alimentaire (Bouguelia, 2012). Ainsi, malgré les nombreux gènes existants pour L. monocytogenes, l’utilisation du dépistage moléculaire est moins efficace. Il existe une technique pour résoudre ce problème, mais celle-ci contribue à l’augmentation de la durée du temps

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d’analyse de détection (Bouguelia, 2012). Cette technique couple la méthode de dépistage moléculaire à des méthodes de coloration effectuées au préalable, telles que l’EMA ou PMA. Ce sont des agents intercalants inhibant la détection des bactéries non viables par altération de leur ADN (Bouguelia, 2012).

Figure 3: Illustration comparative de l’îlot de pathogénicité du gène prfA des espèces Listeria spp. (Vazquez-Boland et al., 2001)

2.4.2. Méthode immunologique

Du point de vue immunologique, Listeria monocytogenes possède de nombreuses protéines (Tableau 5) ayant servi d’antigènes pour sa détection. Parmi ces protéines, la listériolysine O (LLO) est la plus utilisée puisque c’est une toxine de Listeria monocytogenes principalement importante pour sa virulence dans les cellules phagocytaires (Lopez, 2008). Elle est également très utilisée puisque c’est par elle que se fait le dépistage d’infection de L. monocytogenes dans le système nerveux central lorsque la détection sur la culture bactérienne est négative (Lopez, 2008). D’autres protéines chez L. monocytogenes comme celle codées par le gène prfA peuvent être utilisée pour sa détection puisqu’elles ont une expression maximale à la température du corps humain (37°C). Cependant, l’expression des

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protéines codées par les gènes de l’îlot de pathogénicité du gène prfA de L. monocytogenes (Figure 3) est faible à basses températures. À ces températures, la transcription du gène prfA est inactivée d’où les protéines résultantes (ActA, LlO etc.) ne sont pas exprimées. Elle ne sont donc pas de bonnes cibles antigéniques pour des échantillons alimentaires réfrigérés comparativement à la p60 codée par le gène iap ( Beauchamp, 2012a; Beauchamp et al., 2012b; Kohler et al., 1990), ou la protéine p66 reporté dans la littérature (Tao et al., 2006). Ces deux gènes sont intéressants car ils appartiennent au domaine LysM contenant des enzymes impliquées dans la dégradation de la membrane cellulaire (division cellulaire) (Bierne & Cossart, 2007).

Les inconvénients du dépistage immunologique pour L. monocytogenes sont leur incapacité permettre une détection en temps réel ainsi que la faible sensibilité et spécificité de détection qu’elle présente comparativement au dépistage moléculaire. Ainsi, cette méthode de dépistage est le plus souvent couplée à des méthodes émergeantes (SPR) ou des méthodes de concentration (immuno- magnetic separation, IMS) des cellules bactériennes pour augmenter son niveau de sensibilité et son efficacité (Bouguelia, 2012).

Tableau 5: Liste de quelques protéines de surface utilisée dans la littérature comme antigène de détection de Listeria monocytogenes

Protéine de surface Rôle Anticorps existants Référence 62 (lmo0610) putative LPXTG-motif cell-wall anchor- domain protein Anticorps polyclonal Anti-listeria (T. Geng et al. 2003; Tao et al., 2006) 58 (lmo0355) Flavocytochrome C fumarate reductase chain A homolog protein

41 50 (lmo2455) enolase 43 (lmo2459) glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase 30 (lmo0041) hypothetical phospho- sugar binding protein

66 (lmo2691) N-acetylmuramidase

MAb C11E9, mAb C11E9 and EM-7G1

Listeria, cellule entière

Anticorps B4 : utilisé pour capturer

la bactérie avant la PCR. Ils sont capables de différencier des L. monocytogenes vivantes des L. monocytogenes qui ont été tuées par la chaleur, les acides,

les bases, les détergents ou l’irradiation (Solve et al.,2000) 60 Protéine d’évasion et du remodelage du peptidoglycane Anticorps monoclonal et polyclonal (Coutu el al., 2014; Beauchamp et al., 2012b; Faith et al., 2007;

42 Ruhland et al., 1993) 80 et 71 (Internaline : InlA et B)

Invasion des cellules phagocytaires Monoclonal mAb2B3 (Hearty et al., 2006) 90 Protéine de polymérisation de l’actine Polyclonal et monoclonal Brundage et al., 1993