Méthodes de détection génotypiques

Pour s’assurer qu’une souche a un gène de résistance spécifique, des techniques de détections génotypiques telles que le PCR ou la biopuce peuvent être utilisées. Le désavantages du PCR, c’est qu’on ne peut vérifier qu’un gène ou quelques gènes à la fois soit par PCR simple ou multiplexe alors que la méthode de biopuce permet la détection de plusieurs gènes de résistance à la fois [104]. Le principe de la biopuce est d’extraire l’ADN des différentes souches de SARM et de comparer leurs gènes avec un S. aureus étalon. L’ADN subit une amplification afin d’obtenir suffisamment de matériel génétique. Ensuite, l’ADN est marqué par des colorants, soit la cyanine 3 (fluorochrome vert) ou la cyanine 5 (fluorochrome rouge). Une fois marqué l’ADN est déposé sur une lame de verre qui possède fixée à sa surface, des fragments de gènes de résistance et de virulence de S. aureus [105]. Chaque point de fluorescence émise de la puce est analysé individuellement par un scanner à très haute résolution à la longueur d'onde d'excitation de la cyanine 3 puis de la cyanine 5. L'image scannée est ensuite traduite en niveaux de gris qui représente l’intensité de fluorescence. Puis, l'intensité du signal entre le vert et le rouge est comparée et analysée par bio-informatique, ce qui permet de s’assurer de la présence d'un gène sous différentes conditions (Figure 4).

Figure 4. Schématisation du principe de la puce à ADN (adapté du Service de génomique du département de biologie de l’École Normale Supérieure de Paris).

Plusieurs biopuces de S. aureus ont été mises sur le marché dont la StaphyType de CLONDIAG en Allemagne qui reconnait 330 séquences spécifiques. Elle détecte une grande variété de résistances aux antibiotiques (acide fusidique, aminoglycosides, bléomycine, chloramphénicole/florfénicol, lincosamides, macrolides, mupirocine, streptogramines, streptothricine, tétracycline, triméthoprime et vancomycine), de marqueurs d’espèces, de méthode de typage (SCCmec, spa) et de marqueurs de virulence. Sa grande représentativité explique pourquoi elle est utilisée dans plusieurs études [89, 106, 107]. La biopuce StaphyType de CLONDIAG, utilise une nouvelle technologie. En effet, la biopuce est localisée au fond de puits. L’ADN de S. aureus à tester est marqué à la biotine puis l’hybridation avec la biopuce donne un profil d’hybridation spécifique à la souche. La détection des profils se fait par méthode de coloration par précipitation (HRP (Peroxydase

de Raifort)) à l’aide du conjugué à la streptavidine et du substrat colorimétrique nommé ‘Seramun Green’ [107]. Ceci permet d’obtenir des profils d’hybridation pour les différents gènes de résistance aux antibiotiques, de virulence et de marqueurs d’espèces composants les souches à tester.

Figure 5. Schématisation du principe de la puce à ADN StaphyType de Clondiag (Adapté du site de la compagnie Alere).

L’équipe de Zhu (2007) quand à elle, a mis sur pied une biopuce qui reconnait six gènes de résistances aux antibiotiques (mecA, blaZ, aac(6’)-Ie-aph(2’’), ermA, ermC et

msrA) ainsi que la région variable 16S de l’ARNr pour différencier les différents espèces de

staphylocoques [108]. L’équipe de Monecke, en 2005, a développé une biopuce qui reconnait 38 cibles de S. aureus, dont des gènes de résistance, des toxines et quelques contrôles spécifiques à l’espèce [104]. Spence et coll. (2008) ont produit une biopuce reconnaissant 84 cibles de S. aureus. Elle reconnait des gènes spécifiques à l’espèce (cap,

coa, cpn60, femA, nuc, et tpi), de résistance aux antibiotiques (aminoglycosides,

bléomycine, érythromycine, lincosamides, macrolides, streptogramines, tétracycline, triméthoprime et vancomycine), de toxines (toxine exfoliative, entérotoxine et hémolysine) et de virulence (adhésine, biofilm et capsule). De plus, elle peut analyser treize souches

Biopuce au fond des puits Préparation de l’échantillon et marquage à la biotine Hybridation à la puce et réaction colorimétrique Enregistre- ment de l’image et analyse Présentation des résultats

simultanément [109]. Finalement, une biopuce a été réalisée pour une étude épidémiologique de SARM [110]. Elle contient 221 gènes et utilise 390 amorces pour l’amplification des cibles avant l’hybridation et pour identifier les gènes ou les allèles caractéristiques de S. aureus codant pour des gènes de virulence, de résistance aux antibiotiques, de régulateurs génétiques ainsi que des gènes constituants les ilots génomiques [110].

La méthode de biopuce semble plus avantageuse que le PCR conventionnel grâce aux multiples gènes de résistance aux antibiotiques, de virulence et de marqueurs d’espèce qui peuvent être testés simultanément. Cependant, les désavantages de la méthode est que la biopuce est moins sensible et plus coûteuse que le PCR conventionnel. Le PCR quand à lui, est une méthode plus laborieuse mais plus sensible et spécifique. En effet, les PCR servent souvent à compléter les résultats négatifs des gènes de résistance obtenus par biopuce, car cette dernière peut parfois être moins sensible que celle du PCR. Les réactions PCR sont en effet plus sensibles, car même si le gène n’est présent qu’en une seule copie, il sera tout de même amplifié. Tandis qu’il faut en général que la cible soit présente en quantité suffisante afin qu’elle soit reconnue par la biopuce. De plus, les résistances génotypiques associées à des mutations ne peuvent être détectées par des biopuces telles que décrites précédemment. Par exemple, la résistance aux quinolones est principalement due à deux cibles intracellulaires, soit l’ADN gyrase et la topoisomérase IV qui sont des enzymes essentiels à la réplication de l’ADN de la bactérie. Or, un seul point de mutation dans ces cibles encodant pour un acide aminé peut causer une résistance aux quinolones. Pour détecter ces mutations, il est alors préférable de faire des PCR pour amplifier ces gènes puis de séquencer l’amplicon. Ces séquences sont ensuite comparées avec la séquence étalon [111].

2.2.3 Généralités sur la résistance aux antibiotiques de SARM