Méthodes de détection directe dans les tissus

Parmi les méthodes de détection directe de T. gondii dans les tissus, la visualisation microscopique du parasite est peu sensible et rarement employée. La culture cellulaire, quant à elle, est possible et relativement rapide (3 à 5 jours), mais est moins sensible que l’essai biologique ou que les techniques de biologie moléculaire au profit desquels elle a été abandonnée au fil des ans (Jitender Prakask Dubey, 2010). Ces dernières méthodes, ainsi que les récentes innovations en matière de détection directe de T. gondii, sont expliquées plus en détails ci-après.

La recherche de kystes tissulaires se fait souvent à partir du cœur, du cerveau et des muscles (Jitender Prakask Dubey, 2010). L’isolement du parasite par essai biologique chez le chat ou la souris demeure l’épreuve de référence et a l’avantage d’évaluer la viabilité et le pouvoir infectieux du parasite. La procédure chez le chat et la souris consiste en la mise en solution de tissu animal suspecté de contenir des parasites, suivi de son inoculation par voie orale ou intrapéritonéale respectivement. Chez la souris, l’infection est confirmée par la séroconversion et la présence de kystes tissulaires dans le cerveau. Chez le chat, l’excrétion d’oocystes dans les fèces permet de conclure à une infection réussie. Le seuil de détection de l’essai biologique chez la souris est d’un kyste par 100g de tissus porcins. Cette technique a une spécificité optimale de

100%, mais manque de sensibilité puisqu’elle permet l’analyse d’une portion relativement petite de tissu (<100g pour la souris, 100-500g pour le chat) qui peut être exempte de parasite, même si l’hôte en héberge ailleurs dans son organisme (Jitender Prakask Dubey, 2010). De plus, la procédure est laborieuse, coûteuse et implique l’utilisation expérimentale d’animaux.

Des techniques de réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont été développées pour détecter T. gondii dans la viande. Elles sont considérées très sensibles, spécifiques et pouvant fournir un diagnostic rapide. La PCR en temps réel (qPCR) a l’avantage de procurer des informations concernant la quantité d’acide désoxyribonucléique (ADN) présente dans l’échantillon. Le gène B1 (35 copies) et l’élément 529-bp (300 copies) sont les marqueurs les plus fréquemment utilisés. Le caractère hautement répétitif de la séquence non-codante 529-bp en fait un marqueur 10 à 100 fois plus sensible pour la détection du parasite que le gène B1 (Jitender Prakask Dubey, 2010). Il a également une bonne spécificité, puisqu’il n’est pas présent dans le génome de l’homme, de la souris et de parasites génétiquement proche de T. gondii, dont entre autres Sarcocystis spp. et Neospora caninum (Opsteegh et al., 2010). La sensibilité avec laquelle les techniques PCR peuvent détecter T. gondii dans la viande varie selon la méthode d’extraction et de purification d’ADN utilisée, la séquence ciblée, la technique d’amplification et le type d’échantillon (Paredes et al., 2016). La distribution hétérogène des kystes tissulaires combiné au petit volume de tissu pouvant être traité par PCR limite la détection chez l’animal. L’ADN est habituellement extrait d’au maximum 50 mg de viande pour procéder à une PCR (Opsteegh et al., 2010). La logique voudrait que l’on augmente le volume de viande duquel l’ADN est extrait pour ainsi augmenter la sensibilité de la méthode. Malheureusement, si on procède ainsi, l’ADN de T. gondii, généralement peu présent, sera dilué dans une quantité énorme d’ADN de fond (hôte et autre). Cela risque fort de résulter en une inhibition de la réaction PCR (Bellete et al., 2003). Une technique d’extraction d’ADN par capture magnétique a été conçue pour pouvoir analyser jusqu’à 100g de tissus tout en concentrant l’ADN parasitaire et en retirant les inhibiteurs potentiellement présents dans la viande tels que l’hémoglobine, la myoglobine, des substances hormonales et de l’ADN non-ciblée (Opsteegh et al., 2010). Une section spécifique du génome de T. gondii est isolée lors de la capture magnétique, soit l’élément répétitif 529-bp. Il est hautement conservé entre les souches de T. gondii, ce qui le rend idéal pour la détection, mais inadéquat à des fins de génotypage. La technique de capture magnétique spécifique

combinée au PCR en temps réel (MC-PCR) a un seuil minimal de détection de 230 parasites par 100g de viande. En préalable à cette méthode, une digestion enzymatique des tissus est nécessaire pour permettre la lyse des formations kystiques, libérant les parasites et augmentant ainsi la sensibilité de détection. Il est important de noter que la PCR ne permet pas de déterminer la capacité infectieuse des parasites détectés dans la viande. Néanmoins, la PCR serait une bonne alternative au bio-essai pour la recherche qualitative et quantitative de kystes dans la viande, et ce particulièrement pour des études à grande échelle (Opsteegh et al., 2010).

Des méthodes automatisées d’identification par fluorescence ont été développées pour détecter et quantifier T. gondii dans les tissus. Une technique par cytométrie en flux démontre de bonnes performances, mais uniquement sur un volume très restreint de tissus (un cerveau de souris) contenant au minimum 70 kystes parasitaires. Une technique par microscopie à haut débit démontre quant à elle une limite de détection plus intéressante, mais est aussi limitée par le volume de tissu pouvant être analysé (Aldebert et al., 2011).

La PCR numérisée par gouttelettes (ddPCR) est une technique en émergence qui intéresse beaucoup les parasitologistes. Son principal avantage est qu’elle est indépendante de toute courbe de calibration et qu’elle permet de quantifier une très faible concentration d’ADN, même en présence de nombreux inhibiteurs. Bien qu’aucune étude ne soit encore publiée concernant l’utilisation de cette technique pour quantifier T. gondii dans la viande, ses qualités poussent à croire qu’il serait prometteur de s’y intéresser. Toutefois, selon une étude l’ayant comparé au qPCR dans le but de quantifier Cryptosporidium dans des matières fécales, son utilisation serait deux fois plus coûteuse (Yang et al., 2014). Le rapport coût-bénéfice devient donc important à considérer selon les objectifs de l’étude.