Méthodes d’intégration

Muitos estudos têm sido desenvolvidos com enfoque na descoberta de marcadores moleculares que sejam confiáveis e facilmente aplicáveis com o intuito de diagnosticar o câncer precocemente (BORKOSKY et al., 2008). A família ING corresponde a um grupo de genes que desempenham um papel fundamental em diversas funções celulares e têm sido associadas à inibição da progressão de alguns tipos de câncer, dentre eles o carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (BOSE et al., 2014; THAKUR et al., 2014; ZHANG et al., 2017). Entre os membros da família, ING-1 e ING-2 têm sido estudados como um subgrupo devido às suas sequências de aminoácidos altamente conservadas e também devido às semelhanças entre suas funções supressoras tumorais (ESMAEILI et al., 2016).

As DPM caracterizam-se por uma sequência de alterações histopatológicas decorrentes de eventos moleculares no material genético do epitélio oral, culminando em alterações clínicas que podem vir a apresentar microscopicamente graus variáveis de DE, podendo preceder, por vezes, o CEO (YARDIMCI et al., 2014; SHRIDHAR et al., 2016; SHUBHASINI et al., 2017). Na cavidade oral, as DPM podem se apresentar sob a forma de uma placa branca (leucoplasia), vermelha (eritroplasia) ou vermelha e branca (eritroleucoplasia), sendo a leucoplasia a apresentação clínica mais prevalente (HO et al., 2012; NANKIVELL et al., 2013; YARDIMCI et al., 2014). No presente estudo, evidenciou- se predominância de lesões leucoplásicas, correspondendo a 61,6% da amostra, corroborando com o descrito na literatura (KURIBAYASHI et al., 2015; RAGHUNANDAN et al., 2016; WARNAKULASURIYA; ARIYAWARDANA, 2016; CARRARD; VAN DER WAAL, 2018).

Ao se analisar o perfil socioeconômico da amostra deste estudo, foi observada uma predominância de indivíduos do sexo feminino (65%) e uma idade média geral de, aproximadamente, 57 anos de idade. Acredita-se que o maior percentual verificado para mulheres se deve ao fato destas costumarem procurar ajuda com mais facilidade, seja com o intuito de prevenir e/ou curar. Já em relação à localização, a região intraoral mais afetada foi a língua (n=19; 31,7%), seguida de rebordo (n=12; 20%) e palato (n=19; 20%).Na literatura, verifica-se uma predominância de DPMs na língua e no assoalho bucal; em contrapartida, em países do Sudeste asiático nos quais se tem o hábito cultural de fazer uso do sachê de betel, observa-se uma maior incidência de lesões em mucosa jugal (HO et al., 2009). Adicionalmente, dentre alguns dos fatores associados a um aumento do risco de transformação maligna estão: sexo feminino, localização da lesão em língua ou assoalho bucal

(HO et al., 2012; KURIBAYASHI et al., 2015), devendo-se ter, assim, um cuidado especial quando diante dessas situações.

Em relação à imunoexpressão das INGs 1 e 2 no epitélio de mucosa oral normal, no estudo de Bose et al. (2014) foi verificado que a ING-1 se apresentava predominantemente expressa no núcleo, corroborando com Zhang et al. (2008a), que observaram apenas expressão nuclear, com ausência de expressão citoplasmática. Já em relação à ING-2, no estudo de Pan et al. (2014) foi visto que, em tecidos não neoplásicos, a expressão para este marcador é predominantemente nuclear. A partir da análise das amostras de mucosa oral normal do presente estudo, observou-se um padrão semelhante ao evidenciado nas DPMs para ambos os marcadores, com elevada expressão (predominância de escore 4) nuclear e citoplasmática.

A literatura relata que os níveis de expressão das INGs têm sido relacionados com o desenvolvimento de malignidades, por vezes mostrando-se associados até mesmo com o prognóstico dessas patologias. No entanto, grande parte dos estudos (SOLIMAN et al., 2007; PAN et al., 2014) não se preocupou em discutir acerca da localização intracelular dessas proteínas. De forma análoga à proteína p53, as proteínas da família ING têm funções nucleares e citoplasmáticas, assim sendo, a localização na célula deve ser levada em consideração para que se possa estabelecer correlações entre os níveis de expressão e as evidências clínicas (TALLEN; RIABOWOL, 2014). Apesar de não ter sido evidenciada diferença estatisticamente significativa em relação à expressão das INGs e o risco de transformação malignas nas DPM, essas proteínas podem estar atuando em outras funções, sem necessariamente ocasionar alteração em seus níveis de expressão. Dentre essas funções, as INGs 1 e 2 poderiam estar envolvidas, por exemplo, em mecanismos epigenéticos os quais podem estar relacionados à alteração de função de genes importantes, como p53 e PCNA, que já mostraram ter influência sobre a atividade das INGs (GONG et al., 2005; SOLIMAN et al., 2007; ZHANG et al., 2008a).

Adicionalmente, as INGs 1 e 2 estão envolvidas na regulação de mecanismos epigenéticos através da interação com complexos HDAC. Ao reverter essas modificações que se dão na cromatina, as quais são reversíveis, tem-se a reativação de genes cruciais para o funcionamento normal das células (MENDITI; KANG, 2007). Estudos vêm mostrando que a superexpressão de ING-1 poderia levar à carcinogênese ao impedir a função adequada dos complexos HDAC, uma vez que esta proteína, assim como ING-2, são componentes desses complexos (SOLIMAN et al., 2007; BOSE et al., 2014; THAKUR et al., 2014). Isso ocasionaria o controle inapropriado da expressão gênica, podendo modificar outras proteínas,

como p53. A superexpressão de HDAC é um achado comum nas DPM, e esta mudança costuma ocorrer no princípio do processo carcinogênico (CHANG et al., 2009).

No presente estudo, em relação aos escores de expressão imuno-histoquímica nos espécimes de hiperceratose e DE, observou-se que a maioria dos casos apresentou uma elevada marcação, com predominância de escore 4, para ambas as proteínas - ING-1 e ING-2. Em certos tipos de câncer, a expressão reduzida ou perdida de ING-1 e ING-2 tem sido associada à promoção da oncogênese, reforçando sua atuação como um supressor tumoral (TOYAMA et al., 1999; GUNDUZ et al., 2000; ZHANG et al., 2008a). Provavelmente devido às hiperceratoses e DEs não se tratarem ainda de processos neoplásicos em si, e por se mostrarem passíveis de reversão, essas lesões ainda apresentam uma elevada expressão dessas proteínas, assemelhando-se à expressão nos espécimes de mucosa oral normal. Dessa forma, acredita-se que a redução da expressão das INGs deva ocorrer apenas quando já se tem um processo neoplásico instalado.

Já ao se considerar os níveis de expressão por compartimento celular, foi observado que a maioria dos casos (93,3%, tanto para ING-1 quanto para ING-2) apresentou, simultaneamente, marcação nuclear e citoplasmática. Normalmente, as proteínas ING apresentam-se expressas no núcleo. Estudos apontam (ZHANG et al., 2008a; BOSE et al., 2014) que em alguns processos neoplásicos, tem-se um aumento da expressão citoplasmática, sendo esta considerada uma localização ectópica para essa família proteica. No estudo de Bose et al. (2014), em espécimes de CEO se observou expressão de ING-1 tanto nuclear quanto citoplasmática, com predomínio desta última. Apesar de alguns estudos mostrarem que a expressão citoplasmática das INGs estaria associada à sua perda de função (ZHANG et al., 2008a; Li et al., 2011a), evidências recentes têm comprovado que a expressão ectópica do ING-1 seria capaz de induzir a apoptose, mostrando-se, por vezes, como um indutor de apoptose mais potente do que o seu tipo selvagem expresso no núcleo. Além disso, uma forte correlação entre a redução de expressão da proteína antiapoptótica Bcl-xL e uma elevada expressão citoplasmática do ING-1 foi evidenciada em espécimes de CEO (SOLIMAN et al., 2007; BOSE et al., 2013; BOSE et al., 2014). A superexpressão citoplasmática de ING-1 também tem sido associada à ativação de genes que interagem com o p53, como PCNA, inibidor de quinase ciclina-dependente (CDK) e fatores pró-apoptóticos, como BAX. Esses achados fornecem uma ligação potencial entre as INGs e o p53, sugerindo que as proteínas da família ING podem exercer suas funções, pelo menos em parte, através das vias de sinalização do p53 (GONG et al., 2005).

Como nas hiperceratoses e DEs se observam concomitantemente elevada expressão nuclear e citoplasmática, considerando tratarem-se de lesões reversíveis, as quais podem progredir ou não para uma malignidade, sugere-se que poderia estar havendo uma relação compensatória quanto à expressão intracelular dessas proteínas. Parte das proteínas ING evidenciadas nestas lesões, as quais podem se encontrar em um processo de progressão para um CEO, poderia estar perdendo a sua função, fato este representado pelo aumento da expressão citoplasmática. Ao mesmo tempo, por outro lado, acredita-se que ainda se teriam INGs ativas, expressas no núcleo, que estariam contrabalanceando o processo. Dessa forma, a função dessas proteínas ainda seria preservada nas desordens potencialmente malignas. Provavelmente, com a progressão da carcinogênese e após a instalação da doença invasiva, seria notável uma perda maior ou total da expressão nuclear das INGs 1 e 2, associada a um aumento da expressão citoplasmática. Ou seja, a marcação citoplasmática e nuclear nas DPM pode representar que há um mecanismo de balanceamento e que ainda há uma atividade no núcleo que pode ser considerada um fator protetivo para as células.

A partir da forma como ocorre a interrelação entre a família ING e as diferentes proteínas e fatores de transcrição, os genes ING poderiam atuar ora como supressores tumorais, ora como oncogenes. O proto-oncogene Src, uma tirosina quinase não receptora com um papel importante na transdução do sinal do fator de crescimento, fosforila a ING-1, reloca esta para o citoplasma, regulando, assim, suas habilidades pró-apoptóticas (TALLEN; RIABOWOL, 2014). Isso enfatiza que a atuação dessas proteínas na transformação maligna não se dá de forma isolada. No entanto, devido à escassez de dados na literatura envolvendo a expressão das INGs nas DPM, é importante a realização de mais estudos envolvendo sua expressão com outros fatores com os quais elas se se relacionam, como PCNA, p53, Bcl-2 e BAX.

Ao correlacionar os níveis de expressão geral, nuclear e citoplasmático entre si, no presente estudo, evidenciou-se uma correlação positiva e estatisticamente significativa quando se comparou a expressão geral e citoplasmática para ambos os marcadores – ING-1 e ING-2. Bose et al. (2014) verificaram que o aumento da expressão geral de ING-1 estaria associado ao aumento concomitante dos seus níveis citoplasmáticos em amostras de CEO. Já ao se comparar o padrão de expressão geral entre ING-1 e ING-2, Singh et al. (2002) verificaram em espécimes de câncer de próstata uma expressão inversamente proporcional, correlacionando uma expressão reduzida de ING1 com níveis aumentados de ING-2 (ESMAEILI et al., 2016). No entanto, os resultados do presente estudo mostram a existência de uma correlação moderada e diretamente proporcional entre estas variáveis. Isso

provavelmente se deve ao fato de as hiperceratoses e DEs ainda não se caracterizarem como uma lesão maligna, não havendo, assim, alterações genéticas e moleculares suficientes para que se observe essa relação inversa entre os marcadores.

Em relação aos escores de imunomarcação nas DPM e o grau histopatológico - baixo ou alto risco - dessas lesões, na presente pesquisa não foi verificada diferença estatisticamente significativa entre essas variáveis. A maioria dos estudos indica que o grau de DE estaria associado com um aumento do risco de transformação maligna. Apesar disso, é importante ressaltar que altas taxas de transformação também já foram evidenciadas em tecidos que não apresentam características morfológicas de malignidade, como as hiperceratoses (HOLMSTRUP et al., 2006; HO et al., 2009). No entanto, os mecanismos envolvidos nesses casos com ausência de displasia ainda não foram elucidados, apesar destas lesões apresentarem algumas características genéticas e moleculares semelhantes às do carcinoma epidermoide oral (MITHANI et al., 2007).

Grande parte dos estudos desenvolvidos com as INGs aborda o seu comportamento frente a lesões neoplásicas. A ativação de determinadas vias que estariam mais diretamente relacionadas à carcinogênese, bem como a relação das INGs com proteínas que costumam estar alteradas em malignidades, como p53, poderiam levar ao padrão de expressão observado em neoplasias. O fato das DPMs serem consideradas lesões com capacidade de reversão, não caracterizando ainda um processo neoplásico, poderia justificar a semelhança de marcação observada ao se comparar espécimes de mucosa oral normal com os de desordens potencialmente malignas. No entanto, ainda se tem poucos trabalhos que associem a expressão das proteínas ING com lesões na região de cabeça e pescoço, incluindo CEO e desordens potencialmente malignas. Por isso, faz-se necessário o desenvolvimento de mais pesquisas de modo a buscar um melhor entendimento do mecanismo preciso das INGs nessas lesões, investigando essa relação, bem como a interação dessas proteínas com outros genes/fatores de transcrição/proteínas, como HAT, HDAC, PCNA, BAX e Bcl-2. Estes provavelmente atuariam, de maneira direta ou indireta, influenciando a expressão e a atividade das INGs nessas lesões.