C. Dysfonction mitochondriale post traumatique
7. Méthodes d'évaluation de la fonction mitochondriale
Capacité de rétention calcique (CRC)
L’étude du seuil d’ouverture du mPTP et donc de la résistance mitochondriale au stress calcique peut être réalisée par analyse de la CRC obtenue par des ajouts réguliers ex vivo de petites quantités de calcium sur les mitochondries isolées extriates d’un cerveau frais par ultracentrifugation. La CRC du pore correspond à la quantité de calcium nécessaire à apporter pour obtenir l’ouverture du pore. En pratique, une quantité fixe de mitochondries est exposée de manière régulière (toutes les minutes) à un ajout d'une quantité fixe de calcium afin d'observer en spectrofluorimétrie l'absorption du calcium du milieu extra vers le milieu intra mitochondrial jusqu'à ce que les capacités d'absorption mitochondriales de Ca soient
dépassées entrainant l'ouverture du mPTP. Ce test ne reflète pas la fonctionnalité du mPTP in vivo mais plutôt les capacités maximales du pore en conditions extrêmes.
Etude de l'apoptose
- Etude immunohistochimique: marquage TUNEL, caspase 3 clivée
Ces études immunohistochimliques permettent l’analyse en microscopie optique de différents composants cellulaires par un marquage spécifique de marqueurs de l’apoptose.
Le principe de la technique de TUNEL est de révéler la présence de cassures dans l’ADN par une réaction de polymérisation avec par la suite mise en évidence, via une
réaction de coloration, de nucléotides modifiés. L'utilisation de la
déoxynucléotidyltransférase (Tdt, pour Terminal déoxynucléotidyltransférase), permet d'ajouter des désoxyribonucléotides aux extrémités 3' OH terminales de l'ADN. Un système de révélation est associé à ces nucléotides (par exemple, déoxyuridine biotinylée).
Au sein des tissus, l’apoptose peut être recherchée également par la détection immunologique des formes clivées/activées des caspases, protéases initiatrices ou exécutrices de l’apoptose. La détection immunocytochimique de la caspase-3 clivée, sert couramment à mettre en évidence la présence de cellules apoptotiques.
- Etude du cytochrome c
Cette mesure peut être effectuée par spectrométrie de masse (séparation en phase gazeuse de molécules chargées en fonction de leur rapport masse/charge) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) (séparation de composés entraînés par un liquide (phase mobile) à travers un solide divisé (phase stationnaire) qui est soit placé dans un tube (colonne chromatographique), soit fixé sur une surface inerte) ou une association des deux.
Etude du calcium intra mitochondrial
Cette étude permet de déterminer si les taux de calcium matriciels augmentent en conditions pathologiques. Ceci permet ainsi d'associer cette élévation de Ca à un effet délétère secondaire (déclenchement d'une cascade apoptotique...). Elle peut se faire par le biais de différentes techniques (sondes Rhod 2, Immunofluorescence, Spectrofluorimétrie...). La méthode utilisée peut être la spectrométrie d’émission ou d’absorption. La première, utilisée ici, présente deux
avantages : plus de sensibilité avec moins d’interférence et analyse qualitative possible de plusieurs éléments. La spectrométrie d’émission atomique plasma-couplée correspond à l’étude optique des radiations émises par les atomes passés dans un état excité (ionisé). L’ionisation est réalisée dans une torche à plasma. La source lumineuse provient de l’échantillon, mais la torche à plasma permet d'atteindre des températures de I'ordre de 8000K, augmentant ainsi le nombre d'atomes à l'état excité, et donc la sensibilité. Le principe repose sur le fait que les électrons des atomes excités (ionisés), lorsqu'ils retournent à l'état fondamental, émettent un photon dont l'énergie (longueur d'onde) est caractéristique de l'élément. La lumière émise par le plasma est en ce cas analysée par un ou plusieurs monochromateurs, par un réseau polychromateur, ou encore une combinaison des deux. La lumière émise par l'élément recherché est alors détectée et mesurée, et son intensité comparée à celle émise par le même élément contenu dans un échantillon de concentration connue.
Etude en microscopie électronique (ME) (cf œdème cérébral)
L’étude des mitochondries en ME permet d'observer les anomalies morphologiques observées au décours de conditions pathologiques. A la suite d'un TC les mitochondries présentent un gonflement matriciel une rupture de la membrane externe et désorganisation des crêtes de la membrane interne (Singh, Sullivan et al. 2006). Cette analyse permet de localiser les sous types cellulaires préférentiels où sont observées ces anomalies (Lifshitz, Janmey et al. 2006)
Chaine respiratoire mitochondriale en oxygraphie
La chaine respiratoire est étudiée en oxygraphie à l'aide d'une électrode de Clark dans des conditions mimant le milieu humain (température 37°C, ajouts de substrats et de molécules énergétiques). En pratique, un substrat de la série de complexes I III IV ou II III IV est ajouté à une suspension de mitochondiries fraiches extraites du cerveau également par ultracentrifugation. Ensuite, on ajoute de l'ADP pour initier l'état III (ou stade de phosphorylation oxydative où la consommation en oxygène s’accélère), suivi par l'addition d'oligomycine, un inhibiteur de l’ATPase, pour monitorer l'état IV de la respiration (ralentissement de la consommation en O2). Le rapport état III/ état IV correspond au respiratory control ratio (RCR) et sert à
évaluer la fonctionnalité de la chaine respiratoire. Cependant, elle ne reflète pas les conditions réelles in vivo car en situation pathologique les substrats et différents apports énergétiques peuvent être défaillants. Cette mesure permet d'évaluer le bon fonctionnement de la chaine respiratoire en conditions énergétiques optimales.
8. Conclusion
La dysfonction mitochondriale post traumatique comporte donc plusieurs volets : anomalies morphologiques et fonctionnelles avec trouble de la chaine respiratoire et apoptose cellulaire. Ces anomalies fonctionnelles sont en partie responsables de la morbimortalité de cette pathologie. L’amélioration de cette dysfonction mitochondriale permettrait ainsi d’améliorer le pronostic neurologique des patients.
Cette dysfonction mitochondriale permet d’introduire le paragraphe suivant concernant les troubles du métabolisme cérébral survenant en post traumatique. En effet, cette dysfonction a des conséquences importantes sur le métabolisme cérébral comme ceci va être décrit.