5.5.1 Réactifs de révélation chimique sur TLC
L’utilisation de réactifs chimiques en solution, vaporisés sur les chromatogrammes sur couche mince, permettent de compléter les observations faites visuellement sous les lampes UV à 254 nm (extinction de la fluorescence) et 366 nm (fluorescence propre). En effet, un choix adapté de réactifs permet non seulement de mettre en évidence des constituants ou classes de constituants présents dans un extrait (criblage général), mais offre en plus une méthode simple et rapide pour localiser un composé particulier dans un mélange (extrait, fraction enrichie,…). L’utilisation d’un réactif polyvalent est particulièrement adaptée pour réunir rationnellement les fractions primaires récoltées suite à une séparation préparative ou semi-préparative.
Le Tableau 5.3 présente les différents réactifs chimiques pour TLC utilisés dans ce travail.
Tableau 5.3 – Réactifs chimiques pour la révélation des TLC.
Réactif : subst. révélées Mode d’utilisation
Godin (1954) : réactif polyvalent
Mélanger en parts égales une solution éthanolique de vanilline à 1% et une solution aqueuse d’acide perchlorique à 3 %. Vaporiser le mélange sur la plaque, puis une solution éthanolique d’acide sulfurique à 10 %. Après chauffage intense, les composés organiques apparaissent sous forme de taches colorées.
Chlorure de fer : tanins, polyphénols
Préparer une solution de FeCl3 à 10 % dans un mélange MeOH-H2O
(1:1) et la vaporiser sur la plaque. Les polyphénols apparaissent sous forme de taches de couleur (Wagner et Bladt, 1996).
NST/PEG (Naturstoff-
Polyethylenglykol) : flavonoïdes
Vaporiser successivement une solution méthanolique de
diphénylboryloxy-éthylamine à 1 % (= NST) et une solution éthanolique de PEG 4000 à 5 % (= PEG) sur la plaque. Les flavonoïdes apparaissent sous forme de taches fluorescentes orange, jaunes, bleues et vertes à 366 nm (Wagner et Bladt, 1996).
Dragendorff : alcaloïdes
Préparer une solution contenant 0,85 g de nitrate basique de bismuth et 10 g d’ac. tartrique dans 40 ml d’eau (= A) et une solution contenant 16 g de KI dans 40 ml d’eau (= B). Mélanger extemporanément 5 ml de A, 5 ml de B, 100 ml d’eau et 20 g d’acide tartrique. Vaporiser le mélange sur la plaque. Les alcaloïdes apparaissent sous forme de taches orange (Wagner et Bladt, 1996).
Acétate de plomb : coumarines
Vaporiser une solution aqueuse d’acétate de plomb à 5 % sur la plaque. Les coumarines apparaissent sous forme de taches fluorescentes vertes à 366 nm (Wagner et Bladt, 1996).
5.5.2 Mise en évidence de l’activité antiradicalaire sur le DPPH
Les radicaux libres sont produits dans notre organisme sous l’action de facteurs déclenchants externes (UV, radiations ionisantes, métaux de transition, fumées de combustion, poussières d’amiante et de silice, antiseptiques, médicaments, pesticides, solvants,…), mais également dans le cadre de phénomènes biologiques importants, comme la respiration cellulaire. Certaines cellules immunitaires (leucocytes, macrophages) utilisent quant à elles les radicaux libres pour la destruction de microorganismes infectieux dans leurs lysosomes. Parmi les radicaux libres auxquels notre organisme est exposé, on retrouve les espèces réactives de l’oxygène tels que les radicaux superoxyde (O2·-), hydroxyle (OH·) et peroxyles (RO2·), le
péroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’oxygène singulet (1O2). La production permanente de ces
molécules réactives dans notre corps est généralement contrôlée par l’action de systèmes enzymatiques (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase,…) ou d’antioxydants (vitamine E, β-carotène, …). Lorsque cet équilibre précaire est rompu en faveur des radicaux libres, il se produit un « stress oxydatif », qui va entraîner la peroxydation des lipides et l’attaque des bases azotées et des acides aminés. Par les dommages ainsi causés à nos cellules, ces différents mécanismes semblent jouer un rôle prépondérant dans les phénomènes du vieillissement et engendrer des pathologies tels que des cancers et des troubles neurodégénératifs, comme les maladies d'Alzheimer ou de Parkinson. L’apport exogène d’antioxydants (alimentation, médicaments,…) pourrait donc ralentir, voire prévenir, ces désordres physiologiques (Cuendet, 1999 ; Demers, 1999).
Pour détecter l’activité antiradicalaire dans notre laboratoire, nous utilisons le 1,1-diphényl-2- picrylhydrazyle (DPPH), un radical stable, violet en solution et présentant un maximum d’absorption caractéristique à 517 nm. Le protocole appliqué en routine repose sur la disparition de ce maximum lorsque le DPPH est réduit par un composé à propriété antiradicalaire, entraînant ainsi une décoloration. Le test peut être effectué sur plaque TLC (évaluation qualitative ou semi-quantitative d’extraits, fractions ou produits purs) et sur microplaque à 96 puits (évaluation quantitatives de produits purs) :
• Test sur TLC (Cuendet et al., 1997) :
Vaporiser sur les plaques TLC développées et séchées, une solution méthanolique de DPPH à 0,2 %. Après un temps de réaction optimal de 30 min, les composés à propriété antiradicalaire sont localisés par l’apparition de zones jaunes sur fond violet.
• Test sur microplaque (Cavin et al., 1998) :
Pour chaque produit pur, préparer une solution-mère méthanolique à 4,5·10-3M (SM), puis en faire cinq dilutions successives d’un facteur 2 (D1-D5). Les opérations décrites
ci-après s’effectuent en duplicat ou en triplicat pour chaque produit testé. Dans des alvéoles distinctes d’une microplaque à 96 puits (Falcon), ajouter à 5µl de ces solutions, 225µl de méthanol et 50 µl d’une solution méthanolique de DPPH à 0,022 % : les concentrations finales en produit pur s’échelonnent donc de 80µM (SM) à 2,5µM (D5). L’avant-dernière rangée de 12 puits est utilisée pour les contrôles négatifs (230µl MeOH + 50 µl sol. DPPH) et la dernière pour les blancs (280 µl MeOH). Après 30 min, insérer la microplaque dans un lecteur spectrophotométrique adapté (p. ex. SLT Spectra Reader) et relever les absorbances à 517 nm. Calculer ensuite les pourcentages d’activité antioxydante à l’aide de la formule :
(
)
(
)
− ⋅ − − = b y b x 100 100 activité %x = absorbance de la solution de produit pur en présence de DPPH y = absorbance moyenne des solutions de contrôle négatif
b = absorbance moyenne des solutions de blanc
Avant d’utiliser les microplaques, il convient d’en faire une mesure spectrophotométrique à vide à 517 nm. Pour chaque puits, la valeur d’absorbance à vide sera déduite de celle mesurée lors de l’expérience proprement dite. Le 2,6- di(tert-butyl)-4-méthylphénol (butylhydroxytoluène, BHT), un antioxydant de synthèse utilisé dans l’industrie alimentaire (E 321), et la quercétine sont utilisés comme produits de référence respectivement modérément et fortement actifs. Cette approche quantitative permet de déterminer le paramètre IC50, qui représente la
5.5.3 Mise
en
évidence
de
l’activité
inhibitrice
de
l’acétyl-
cholinestérase
L’acétylcholinestérase (AChE, EC 3.1.1.7) est l’enzyme responsable de l’hydrolyse du neurotransmetteur acétylcholine (ACh) au niveau des synapses cholinergiques. Les inhibiteurs de cette enzyme (iAChE) provoquent donc une augmentation de la transmission cholinergique, avec les effets parasympathomimétiques qui l’accompagnent. Leur usage clinique regroupe des indications telles que la maladie d’Alzheimer, le glaucome et la myasthénie grave.
Le test de l’inhibition de l’AChE mené dans notre laboratoire pour le criblage des extraits et produits naturels est le suivant (Marston et al., 2002) :
Préparer une solution d’AChE à 1000 unités dans 150 ml de tampon tris de pH 7,8 (6 g/l H2O
= 0,05 M) et y ajouter 150 mg d’albumine (= sol. A). Mélanger 1 part d’une solution éthanolique d’acétate de 1-naphtyle à 250 mg/100ml et 4 parts d’une solution aqueuse de « Fast Blue Salt B » à 200 mg/80ml (= sol. B). Vaporiser la solution A sur les plaques TLC développées et séchées, puis incuber 20 min en atmosphère humide (boîte en PEHD avec un fond d’eau) à 37 °C. Vaporiser ensuite la solution B : une coloration pourpre apparaît sur la plaque TLC après 1-2 min, sauf dans les zones incolores occupées par des inhibiteurs de l’AChE. Les extraits et fractions sont déposés à raison de 100µg, les produits purs de 10 µg.