1. Justification de la stratégie
En complément de la stratégie d’orientation de la différenciation, une seconde méthode vise à limiter l’hétérogénéité cellulaire en sélectionnant et en purifiant les cellules d’un lignage donné. Des techniques d’extraction sélective fondées sur l’expression spécifique d’antigènes de surface ont d’ores et déjà été expérimentées (Cai et al., 2002; Lee et al., 2005; Liu et al., 2004b; Uchida et al., 2000; Windrem et al., 2004). Elles consistent à « étiqueter » les cellules au moyen d’anticorps, fluorescents ou couplés à des billes magnétiques, dirigés contre le ou les épitopes de surface propres aux cellules d’intérêt. Le tri des cellules est ensuite réalisé par cytométrie en flux (FACS ou MACS). Afin d’accroître la pureté des échantillons cellulaires sélectionnés, des paramètres supplémentaires d’antigénicité, de taille ou de liaison à des molécules particulières peuvent être combinés au cours de la séparation (Capela and Temple,
2002; Rietze et al., 2001). Une autre méthode fondée sur l’expression spécifique de gènes
Des protéines fluorescentes (Chalfie et al., 1994) sont placées sous le contrôle de promoteurs, activés uniquement dans un type cellulaire d’intérêt. Ainsi, les cellules qui fluorescent sont caractéristiques d’un lignage précis et peuvent être séparées des autres cellules par FACS. Jusqu’à présent, ce tri, fondé sur une expression lignage-dépendante de protéines rapportrices, a permis d’extraire des cellules progénitrices à l’aide des promoteurs nestine* ou musashi1
(Wang et al., 2000), des précurseurs neuronaux à l’aide du promoteur de la tubuline α1 (Roy
et al., 2000a; Roy et al., 2000b) ou des cellules oligodendrocytaires à l’aide du promoteur
CNP2 (Roy et al., 1999). Nous avons choisi de tester ce système de sélection sur les cellules souches nerveuses fœtales humaines en culture en utilisant trois promoteurs différents pour diriger l’expression de protéines rapportrices dans des lignages distincts.
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Figure I-18 : Stratégie d’homogénéisation à l’aide de vecteurs induisant l’expression spécifique de protéines
rapportrices et permettant une sélection
des cellules par cytométrie en flux.
2. Description des promoteurs
Les trois promoteurs particuliers qui ont retenu notre attention sont désignés comme étant : - le promoteur de la nestine* de rat, spécifique des cellules nerveuses immatures - le promoteur de la synapsine I* humaine, spécifique du lignage neuronal
- le promoteur de la Protéine Acide Fibrillaire Gliale humaine (GFAP*), spécifique du lignage astrocytaire.
● le promoteur de la nestine*
L’élément activateur du second intron du gène de la nestine* est une région de 637pb située entre les bases 1162 et 1798 chez le rat (Lothian and Lendahl, 1997). Cette séquence, hautement conservée entre l’homme et le rat, est suffisante pour diriger l’expression spécifique du transgène dans les cellules souches immatures et les cellules progénitrices nerveuses. Le promoteur minimum de la protéine du stress hsp68 (Heat Shock Protein 68) est placé en aval de cet activateur pour amorcer la transcription (Roy et al., 2000a).
Lors d’expériences de purification cellulaire, ce promoteur a permis d’isoler après transfection* (au moyen de liposomes) des progéniteurs nerveux à partir de la zone ventriculaire de cerveau humain adulte (Roy et al, 2000). Les cellules sélectionnées expriment de manière uniforme la protéine nestine et ont incorporé pour une majorité d’entre elles du bromodéoxyuridine (BrdU) additionné au milieu de culture. De même, des cellules souches et des précurseurs nerveux ont été isolés à partir de cerveau fœtal humain par transduction au moyen de vecteurs adénoviraux exprimant la protéine GFP sous le contrôle du promoteur de la nestine (Keyoung et al., 2001). Dans cette étude, 99% des cellules sélectionnées expriment le marqueur nestine, 3% le marqueur β3tubuline et 9% le marqueur GFAP.
● le promoteur de la synapsine I*
Un fragment d’environ 470pb du promoteur de la synapsine I humaine (hSYN) permet l’expression spécifique du transgène dans les neurones (Kugler et al., 2001). Etant plus court que le promoteur de l’énolase spécifique des neurones (NSE), le promoteur hSYN est plus approprié pour des constructions lentivirales (Kugler et al., 2003).
Dans le but d'acquérir une expression restreinte aux neurones, la spécificité du promoteur de la synapsine humaine a été évaluée dans le contexte de transductions adénovirales (Kugler et
cocultures de neurones et de glie extraits d’hippocampe de rat fœtal. Cependant, jusqu’à présent, aucune analyse quantitative précise n’a été réalisée et la spécificité d’expression n’a pas encore été testée dans des cultures humaines.
● le promoteur de la GFAP*
Le fragment de 2,2 kb du promoteur de la GFAP humaine (Besnard et al., 1991) permet une expression ciblée du transgène dans les astrocytes (Jakobsson et al., 2003). En effet, des études par transductions lentivirales dans le cerveau de rat (Jakobsson et al., 2003) ou par transfections* transitoires au phosphate de calcium dans des lignées de cellules humaines et dans des cultures primaires de rat (Besnard et al., 1991) ont démontré une expression astrocytaire quasi-exclusive du gène rapporteur. Cependant, aucune analyse quantitative n’a encore été réalisée sur des cellules nerveuses humaines en culture.
3. Principe de la stratégie
La sélection et la purification des cellules d’intérêt est obtenue par expression, au moyen de vecteurs lentiviraux, de protéines rapportrices (eYFP ou eGFP) sous le contrôle des promoteurs spécifiques des différents lignages cellulaires décrits ci-dessus. Les cellules souches nerveuses fœtales en culture peuvent être transduites avec ces vecteurs traceurs et devraient exprimer la fluorescence, une fois différenciées dans le lignage approprié. Ainsi, les cellules fluorescentes devraient être exclusivement des cellules immatures pour le promoteur nestine, des cellules neuronales pour le promoteur de la synapsine ou des cellules astrocytaires pour le promoteur GFAP. Par la suite, les cellules des différents lignages pourront être triées par cytométrie en flux et les populations homogènes greffées dans des modèles expérimentaux adaptés. Ces perspectives alléchantes sont cependant encore éloignées. La première étape de notre étude consiste en effet à vérifier et à valider la spécificité d’expression des différents promoteurs dans les cellules souches nerveuses fœtales en culture par une analyse rigoureuse du phénotype des cellules fluorescentes.