Méthode de spectrométrie de masse MALDI-TOF MS (matrix assisted laser

A- Principe

Des ions de masse et de charge différentes soumis à un champ électrique se déplacent, et la distance parcourue en un temps donné est fonction du rapport masse sur charge (m/z). La première étape consiste à mélanger l’échantillon à la matrice, l’évaporation des solvants conduisant à la cristallisation de la matrice avec l’échantillon. Chaque dépôt est soumis à l’action du rayon laser UV. Le rôle de la matrice est d’absorber l’énergie provenant du laser ce qui provoque la vaporisation de l’échantillon avec formation d’ions de masses différentes. Les ions ainsi formés, généralement de charge +1 dans le cas du MALDI, vont être mis en mouvement sous l’action d’un champ électrique, et l’analyseur va les séparer en fonction de leur rapport m/z. Ils traversent ensuite un certain nombre de grilles d’extraction avant d’atteindre le « tube de vol » à l’extrémité duquel se trouve le détecteur. Les ions sont séparés selon leur temps de vol, ceux de petite taille atteignant les premiers le détecteur. Le temps de vol (time of flight) pour atteindre le détecteur est utilisé pour

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calculer la masse de chaque particule. La somme des ions analysés va former un spectre caractéristique de l’échantillon (figure 7). Un ordinateur pilote l'appareil et effectue l'acquisition des données réduites sous forme de spectres de masse qu'il permet d'analyser. (Carbonnelle & Nassif, 2011). Dans son application en microbiologie, la technique du MALDI-TOF repose sur la détection de peptides. Il s’agit essentiellement de protéines cytosoliques basiques, en quantité abondante, hydrophiles, dont les principales identifiées sont les protéines ribosomales.

Figure 7. Schéma simplifié d’un appareil MALDI-TOF

56 B- Réalisation du test

- La technique est réalisée pour 41 souches de S.pneumoniae et 9 souches de streptocoques selon la méthode de Seng et al. (2009).

- La cible MALDI utilisée est de type Microflex modèle « MSP 96 target polished steel » ref 224989. Nous avons également utilisé le spectromètre de masse (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Germany).

· Préparation de la matrice

Pour 1 ml de matrice, on introduit 2 spatules d’alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (HCCA) dans un tube polypropylène de 1,5 ml, auxquelles on ajoute 500 µl d’acétonitrile HPLC, 250 µl de TFA à 10% (trifluoroacetic acid) et 250 µl d’eau HPLC. Après avoir bien mélangé au vortex, on sonique 10 min ((F: 50/60 Hz) à température ambiante jusqu'à l'obtention d'une solution saturée. La solution est centrifugée pendant 1 min à 13000 rpm puis le surnageant est transféré dans un tube polypropylène à 1,5 ml propre.

· Réalisation des dépôts sur cible MALDI

L’échantillon est déposé en fine couche homogène dans les zones définies (cercles) (ne pas déposer trop de bactéries et éviter d’avoir des aspérités sur le dépôt). Pour une série de 4 dépôts par échantillon, différentes colonies bactériennes sont prélevées, sans salir la cible (traces de doigts, matrice renversée, …) ni la rayer (supports métalliques en acier inoxydable extrêmement lisse). Le plan de la cible MALDI utilisée est complété (plan de cible MSP 96) en indiquant la référence des échantillons déposés. Ensuite 4 spots du témoin positif (1,5 µL de Bruker Bacterial Test Standard BTS) sont déposés en recouvrant chaque dépôt de 1 µL de matrice, et sur la ligne suivante dans la même colonne, 4 spots du témoin négatif (1µL de matrice) sont étalés. Sur les lignes suivantes de la cible MALDI, les échantillons sont déposés en quatre exemplaires dans les zones définies (cercles), en prélevant une colonie bactérienne à l’aide d’une pointe de cône de pipette 10 µL. Chaque dépôt d'échantillon est finalement recouvert avec 1 μL de la solution matrice et laissé sécher.

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· Introduction de la cible MALDI dans le spectromètre de masse Microflex LT et lancement de l’acquisition MALDI-TOF-MS Biotyper

L'analyse est effectuée dans un spectromètre MALDI -TOF MS (Microflex ; Bruker Daltonics avec un laser à azote réglé à 337 nm) avec un logiciel de contrôle FLEX (Bruker Daltonics). Les ions sont accélérés avec une tension de 20 kV. L'extraction des ions pulsés a été optimisée pour 1000 Da.

Un transfert direct des données vers un logiciel d’identification est effectué : logiciel Biotyper RTC type Bruker Biotyper 2.0 avec une approche MSP (Main Spectra Projection) qui retient tous les spectres, il est installé sur le PC d’acquisition associé au spectromètre Microflex .

Les spectres de masse sont obtenus à fréquence maximale (20 Hz soit 20 tirs/seconde par point de dépôt). Une série de 20 tirs suffira à l’acquisition d’un spectre, et les spectres sont traités pour déterminer un spectre moyen par dépôt (Tous les nuages d’ions moléculaires provoqués par les différents tirs du laser ne sont pas identiques à 100%. C’est pourquoi tous les pics sont additionnés par masse. Cela donne un spectre statistique moyen qui est celui qui sera utilisé).

Le spectre obtenu est ensuite comparé avec tous les spectres de référence dans la base de données où les spectres de 2881 espèces sont enregistrés. Le processus d'identification compare et aligne les listes de pics de spectres inconnus avec des listes de pics de spectres de références. Dans la première étape les spectres inconnus sont calibrés avec les spectres de références. Le Biotyper tente de sélectionner et d'aligner les plus hauts pics de chaque spectre. Dans la deuxième étape, le matching des spectres inconnus avec les spectres de référence sera évalué en se basant sur une valeur de score dédiée. Pour cela, l'information des pics du spectre de référence est transformée en une valeur de score maximal accessible. Aussi bien les pics que leur intensité relative sont comparés et repris dans un calcul de corrélation. Le score est le résultat de ce calcul. Si le logarithme de ce score [log(score) maximal 3] est plus grand que 1,9, l’identification se fait au niveau de l’espèce. Si la valeur se situe entre 1,9 et 1,7, l’identification ne va pas plus loin que le genre. Des valeurs inférieures à 1,7 ne permettent pas une identification.

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C- Validation des résultats d’identification Biotyper :

Les résultats d’une cible sont exploitables seulement si les témoins T+ et T- sont valides : - T+ doit correspondre à E.coli avec un score > 1,9.

- T- doit correspondre à un score sans identification < 1,7.

Les résultats d’identification des bactéries sont donnés, sous Biotyper RTC, par un score entre 0 à 3 selon la méthode de Seng et al (2009). L’identification d’un germe est validée lorsque le score est supérieur à 1,9 pour 2 dépôts (même germe retrouvé). Le meilleur score d’identification MS de chaque dépôt est noté. Si l’un des deux scores de l’échantillon est inférieur à 1,9 ou si l’on retrouve 2 germes différents, l’identification n’est pas valide. Cet échantillon est remis sur deux positions supplémentaires et son analyse est relancée (annexe 2, tableau 4).

A partir des valeurs des scores, la construction d’un dendrogramme est effectuée par le logiciel Biotyper MSP. Pour cela nous avons utilisé 46 souches (37 souches de pneumocoques et 9 souches de streptocoques α-hémolytiques). Les Clusters sont ensuite détaillés et analysés en fonction d’un niveau de distance arbitraire de 500.