Méthode

Comme nous l’avons mentionné précédemment (Chapitre 3.3.2, p.21), onze des peaux ont fait l’objet d’analyses IRTF, dont huit présentent les bandes d’absorption caractéristiques du spectre du collagène. Nous ne pourrons donc identifier les processus de dégradation que grâce aux spectres des spécimens 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15 et 16.

49 Chahine, 2013, p.164.

50 Brambilla, 2016.

Fig. 15 : Épais cristaux visibles à la surface du derme du spécimen 14 ©HECR Arc, Goetz, 2016

28 Afin d’identifier les processus de dégradation des peaux de ces derniers spécimens, nous avons examiné l’intensité et la position des bandes d’absorption amide Iet amide II caractéristiques du spectre du collagène, car elles peuvent indiquer des modifications de la protéine51. Grâce à cette méthode, nous pouvons également avoir des indications sur le stade de dégradation physique et chimique des échantillons.

Les trois majeurs processus de dégradation du collagène sont la dénaturation, l’hydrolyse et l’oxydation (Annexe 6, p.99-100).

Bande Nombre d’onde (cm-1) Liaison et mode de vibration

Amide A 3300 cm-1 N-H élongation

Amide B 3070 cm-1 N-H déformation harmonique

Amide I 1650 cm-1 C=0 élongation

Amide II 1550 cm-1 N-H déformation,

C-N élongation

Tableau 4 : Caractéristiques spectrales du collagène ©Derrick, 1991

Pour nous aider, nous avons prélevé un échantillon de peau fraîche sur une hermine conservée par congélation au MHNN. Il nous servira d’échantillon de référence.

Graphe 2 : Spectre de l’échantillon de référence de collagène frais ©HECR Arc, Goetz, 2016

29 Lors de la dénaturation du collagène en gélatine52, le changement le plus notable visible sur le spectre infrarouge est que la bande amide II se décale de 1550 cm-1 à 1530 cm-1. Ce décalage correspond à une augmentation de la séparation des bandes amide I et II à 1650 et 1550 cm-1. La différence de nombre d’ondes (Δν) entre la bande amide I et la bande amide II est calculée pour pouvoir comparer simplement la séparation entre les deux bandes de tous les échantillons et ainsi évaluer leurs stades de dégradation.

Le processus d’hydrolyse peut survenir sur le collagène ou sur la gélatine. Sur le spectre infrarouge, l’hydrolyse se caractérise par une augmentation de l’élongation O-H ou de la déformation des fréquences à 3400 cm-1 et à 1650 cm-1. Puisque la bande amide I se trouve aux environs de 1650 cm-1, une augmentation de la bande O-H à 1650 a pour résultat une augmentation de l’intensité d’absorption ou de la hauteur de la bande amide I. Cela peut se voir en comparant l’intensité d’absorption relative de la bande amide I avec celle de la bande amide II par calcul de leur rapport relatif (AI/AII). Une comparaison des résultats obtenus pour chaque échantillon peut alors être effectuée, afin d’évaluer leurs stades de dégradation.

L’oxydation de la chaîne polypeptidique peut entraîner la formation de composés carbonyliques qui vont absorber dans le domaine infrarouge entre 1700 et 1750 nombre d’ondes. Cela se traduit par un léger épaulement de la bande carbonyle amide I dans cette région, qui engendre une augmentation de l’étendue de la bande. Dans notre cas, le spectre de référence du collagène frais peut être comparé aux spectres des échantillons des spécimens (Annexe 5, Graphe 10, p.95), pour déterminer si ces derniers sont oxydés. Cette méthode est plus empirique que les précédentes et ne donne pas d’indications quantitatives sur le stade de dégradation des échantillons. L’analyse des acides aminés du collagène par chromatographie en phase liquide à haute performance53 donne des résultats plus fiables pour répondre à cet objectif.

La spectroscopie IRTF en mode RTA a déjà été utilisée pour identifier les modifications du collagène sur des spécimens d’histoire naturelle54. Cette étude a eu lieu dans le cadre du chantier de restauration de la Grande Galerie de l’évolution du Muséum national d’histoire naturelle de Paris.

52 Derrick, 1991 [en ligne] ; Vornicu et al., 2015, p.81-82.

53 Derrick, 1991 [en ligne].

30 4.1.2 Résultats

Tableau 5 : Récapitulatif des résultats obtenus grâce à l’intensité et à la position des bandes d’absorption ©HECR Arc, Goetz, 2016

L’échantillon de référence a une séparation entre les bandes de 82 cm-1. Tous les autres spécimens ont une séparation entre les bandes supérieure à 87 cm-1. Pour le spécimen 9, la séparation est supérieure à 100 cm-1.

L’échantillon de référence a un rapport d’intensité des bandes de 1.24, tandis que les rapports d’intensité des bandes des spécimens se situent entre 1.39 et 2.26.

Les spectres des spécimens 5, 7, 9, 14 et 15 présentent un épaulement dans le domaine infrarouge entre 1700 et 1750 nombre d’ondes.

N°

spécimen ^{AI AII AI/AII νAI νAII Δν = νAI - νAII (cm-1) Dégradations}

1 Inexploitable 5 0.131 0.069 1.9 1643 1546 97 ^{- Hydrolyse} - Oxydation - Dénaturation 6 0.059 0.033 1.8 1653 1560 93 ^{- Hydrolyse} _{- Dénaturation} 7 0.150 0.103 1.46 1636 1547 89 ^{- Hydrolyse} - Oxydation - Dénaturation 9 0.053 0.038 1.39 1651 1543 108 ^{- Hydrolyse} - Oxydation - Dénaturation 11 0.043 0.019 2.26 1649 1551 98 ^{- Hydrolyse} _{- Dénaturation} 12 Inexploitable 14 0.171 0.120 1.43 1635 1548 87 ^{- Hydrolyse} - Oxydation - Dénaturation 15 0.228 0.143 1.59 1637 1547 90 ^{- Hydrolyse} - Oxydation - Dénaturation 16 0.058 0.041 1.41 1638 1548 90 ^{- Hydrolyse} _{- Dénaturation} 17 Inexploitable Collagène frais ^{0.257 0.207 1.24 1632 1550 82 -}

31 4.1.3 Interprétation

En comparaison des résultats obtenus sur l’échantillon de référence, nous supposons que tous les spécimens ont subi une amorce du processus de dénaturation et une hydrolyse du collagène. Seuls les spécimens 5, 7, 9, 14 et 15 semblent avoir été touchés par une oxydation du collagène.

Les Graphes 3 et 4 présentent les résultats obtenus par différence de position et par rapport entre les hauteurs des bandes amide I et amide II des spectres des échantillons. Ils permettent de comparer les stades de dégradation des échantillons entre eux.

Graphe 3 : Différence entre les positions des bandes amide I et II des échantillons ©HECR Arc, Goetz, 2016

32 Le Graphe 5 contient les résultats combinés des échantillons analysés par IRTF. Il nous indique que les spécimens 11, 5 et 6 seraient les plus dégradés. Les spécimens 16, 7 et 14 le sont moins. Aucun des spécimens n’est dans un aussi bon état de conservation que l’échantillon de collagène frais de référence. Globalement, le niveau de dégradation des échantillons par hydrolyse se corrèle bien avec leur niveau de dégradation par dénaturation. Seul le spécimen 9 a un niveau de dégradation par dénaturation beaucoup plus élevé que son niveau de dégradation par hydrolyse. Cela peut s’expliquer par le fait que le collagène a été fortement détérioré par oxydation. La modification des chaînes peptidiques résultante a ainsi favorisé le processus de dénaturation du collagène.

Graphe 5 : Résultats combinés des changements de position et de hauteur des bandes amide I et amide II indiquant des modifications du collagène dues à la dénaturation et à l’hydrolyse ©HECR Arc, Goetz, 2016

Il faut toutefois être prudent dans l’interprétation de ces données. La reproductibilité des positions de bande55 indique généralement une marge d’erreur de +/-3 cm-1. C’est pour cela qu’un changement de position de bandes inférieur à 6cm-1 n’est pas significatif.

Il faut aussi être prudent avec les rapports d'intensité calculés sur les spectres des peaux ayant subi différents traitements56. En effet, les spectres des éléments de traitement peuvent interférer avec le spectre du collagène.

55 Derrick, 1991 [en ligne].

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