(traduit de l'anglais par l'auteur de ce mémoire)
Ce p r o t o c o l e est basé sur plusieurs techniques de culture. Les neurones néonataux de l ' h i p p o c a m p e sont cultivés n o r m a l e m e n t à une densité dite élevée ( 2 0 0 0 c e l l u l e s / m m2) dans un m é d i u m e x e m p t d e sérum ou 2 % F B S ( G i b c o ) qui est basé sur Brewer et al (J. Neurosci. R e s . 3 5 : 5 6 7 - 5 7 6 , 1993).
Couvrir les disques d e culture (voir protocole complet plus loin) : (verre ou Aclar # 2 2 C , 5 mil) avec de la p o l y - D - l y s i n e en les trempant dans 5 0 - 2 5 0 ug/ml de poly-D-lysine dans 100 m M de t a m p o n borate à p H 8.5 soit p e n d a n t toute la nuit à 4 ° C ou 2-3 heures avant l'ajout des cellules à la t e m p é r a t u r e de la pièce.
Rincer les disques a b o n d a m m e n t avec de l'eau distillée. Les disques peuvent être séchés et gardés plusieurs j o u r s / s e m a i n e s avant leur utilisation.
Insérer les disques dans une p l a q u e de 24 puits.
Préparer une solution fraîche de papaïne :
Solution de papaïne 30 ml d d H20 24 ml 6.67 X H B S S s o l . 4.5 ml ONAse I ( 20 K unités/ml) 0.4 ml 40X solution 0.750 ml Cystéine 0.3 ml
G a r d e r sur la glace
Ajouter (juste avant la dissection) : Papaïne 360 unités (12 unités/ml final).
Réchauffer la solution d e papaïne pendant 10 m i n u t e s pour permettre à la p a p a ï n e de se dissoudre. Puisque la p a p a ï n e d ' o r i g i n e n ' e s t pas stérile, filtrer la solution à travers un filtre de 0.22 u m avec u n e seringue de 10 ml. Il est b o n d e rincer le filtre en premier avec 10 ml d ' e a u distillée stérile.
Solution à dissection (à utiliser) 4 0 ml Solution à dissection 40 ml 4 0 X solution 1 ml S o l u t i o n à dissection sans 4 0 X solution:
2 0 ml H B S S ( 1 0 X sans C a2 +/ M g2 +/ N a H C 03) 2 ml H E P E S ( 1 0 m M final; stock = 1M at p H 7.6) 173 ml H20 distillée
La solution finale d o n n e r a un p H de 7.4.
-Couvrir les rats ( P I - 3 ) avec de la glace p e n d a n t environ 5 minutes.
-Enlever le c e r v e a u et transférer dans un pétri de 3 5 m m contenant la solution de dissection. C o u p e z - l e en d e u x avec un scalpel sur la fissure délimitant les deux h é m i s p h è r e s , laisser une moitié dans le plat de pétri (sur la glace) p e n d a n t que vous disséquez l'autre moitié.
-Disséquer les h i p p o c a m p e s d e s rats (ce qui est b e a u c o u p plus facile à faire sous un m i c r o s c o p e ) dans un plat d e pétri d e 150 m m contenant du Sylgard p o l y m é r i s é couvert avec un papier W h a t m a n n # 1 ( 1 0 0 m m ) sur lequel il y a suffisamment de solution d e dissection pour tout couvrir.
- C o u p e r c h a q u e h i p p o c a m p e en d e s petites pièces sur un plat de pétri de 35 m m contenant du Sylgard p o l y m é r i s é a v e c un scalpel et transférer vers un plat de pétri de 100 m m contenant la solution de papaïne m a i n t e n u e à u n e température tiède (30-37 ° C sur u n e source de chaleur).
-Pendant toute la dissection, maintenir les m o r c e a u x d ' h i p p o c a m p e s sous 9 5 % d ' o x y g è n e et 5 % d e C 02 en plaçant un tube c o n n e c t é à u n e b o m b o n n e de gaz dans le plat de pétri (faites un trou dans le couvercle, c o n n e c t e z un petit filtre sur le tube et insérer-le dans le trou). Le phénol rouge dans la solution permet de visualiser son p H , la solution est initialement rose mais devrait être orange/rouge une fois q u ' e l l e est saturée avec le m é l a n g e de gaz. Faites circuler le gaz avant de débuter la dissection.
Chaque hippocampe devrait donner 5-10 disques (12-13 mm de diamètre), avec des neurones se développant dans le centre. La suspension de neurones est déposée comme une gouttelette dans le centre occupant approximativement 60 mm (voir plus bas pour les détails).
P r é p a r e r :
Solution de trituration 50 ml Solution de Neurobasal 47.5 ml BSA (300 mg/ml) 332.5 ul 4 0 X solution 1.25 ml DNAse I ( 20 K unités/ml) 0.66 ml
Colonne B S A 3 x 5 ml Solution de trituration 5 ml BSA (300 mg/ml) 0.3 ml N a O H (0.1 N) 0.15 ml
Solution de c u l t u r e 5 0 0 ml Solution d e N e u r o b a s a l 5 0 0 m l S u p p l é m e n t B - 2 7 1 vial ( - 1 1 ml) P e n / S t r e p (stock) 2.5 ml G l u t a m a x ( 2 0 0 m M ) 1.25 ml
À u n j o u r de la p r é p a r a t i o n et le j o u r s u i v a n t si v o u s ajouter de l ' A r a - C a u j o u r 2 , ajoutez:
"Fetal bovine sérum" final = 2 %
*Le j o u r s 5, ajouter u M A r a - C (stock = 2 0 0 X , I m M ) dans la m ê m e solution (voir p l u s b a s ) .
-Après la dissection, p e r m e t t r e aux h i p p o c a m p e s d ' i n c u b e r sur une source de chaleur pour 3 0 minutes
additionnelles, arrêter la dissociation en transférant les m o r c e a u x d ' h i p p o c a m p e s dans un tube stérile de 5 0 ml (contenant déjà 15 ml de solution de trituration) en utilisant une pipette de 5 ml (pipeter p a s plus de 0.5 ml à la fois). Laisser les pièces se déposer p e n d a n t environ une minute. Aspirer le surnageant et transférer les cellules v e r s un tube frais de 15 ml avec de la solution fraîche de trituration pour aider le transfert, remplir le tube j u s q u ' à 12 ml avec la solution de trituration, inverser et laisser les cellules se déposer encore.
-Passer à la flamme la pointe d ' u n e longue pipette Pasteur (9 p o u c e s avec coton), couvrir la pipette avec la solution de trituration (garder la pipette dans un tube vide).
-Enlever le plus de solution possible (faire attention pendant l'aspiration de la solution, l ' A D N des cellules m o r t e s peut causer les m o r c e a u x à monter d a n s la pipette), ajouter environ 2 à 3 ml de solution de
trituration.
-Triturer les cellules avec une pipette Pasteur (environ 4 0 à 100 fois), laisser les m o r c e a u x visibles se d é p o s e r au fond p e n d a n t environ une minute et transférer la moitié supérieure des cellules dissociées dans un tube de centrifugation de 15 ml (en déposant la solution d o u c e m e n t sur le dessus de la solution de centrifugation qui a u n e densité plus grande, i.e. les cellules vont flotter).
-Passer à la flamme la pipette Pasteur un peu plus pour réduire la pointe un peu, ajouter environ 1 à 2 ml de solution de trituration au tube contenant les m o r c e a u x d ' h i p p o c a m p e s (utilisant une pipette Pasteur ainsi la
-Centrifuger avec u n e centrifugeuse clinique à la vitesse # 4 pendant environ 7 minutes. N e centrifuger p a s plus l o n g t e m p s car tous les débris vont aussi se déposer; la solution dense de B S A ralentit la déposition des débris (le temps et la vitesse peut varier suivant la centrifugeuse).
D e n s i t é d e s cellules p o u r la déposition:
Les cellules sont déposées directement sur un disque sec. L'ajout de gouttes de cellules dans des puits remplis ne mènera pas à un nombre aussi élevé de neurones sains.
-Enlever le surnageant, suspendre à n o u v e a u les cellules d a n s environ 2 0 0 ul de solution de croissance d i r e c t e m e n t s u r les cellules et remplacer séquentiellement aussitôt avec 1 ml de solution de croissance fraîche c o n t e n a n t du F B S (si des cellules en extra furent gardées des étapes précédentes, ajouter les à la
solution de croissance). N e j a m a i s laisser les puits vides pendant plus d ' u n e seconde.
-Nourrir les cellules le j o u r 5 ou le j o u r suivant l'ajout de 5 u M d ' A r a - C dans la solution de culture (sans F B S ) pour e m p ê c h e r la division cellulaire, en ajouter un autre 0.5 ml de solution de croissance contenant 10 u M d ' A r a - C . N e pas laisser l ' A r a - C pendant plus d ' u n e semaine (réduire l ' A r a - C à 2.5 u M ou m o i n s le j o u r 5 ou le j o u r 9 en remplaçant 5 0 % de la solution de croissance. À partir de ce m o m e n t , nourrir les cellules deux fois par s e m a i n e s en remplaçant la moitié de la solution de croissance. Essayer de préparer de la solution de croissance fraîche à chaque fois que v o us nourrissez les cellules.
A l i q u o t e s de s o l u t i o n stock:
- A r a - C (1 m M ) V W R cat # 8 0 0 5 6 . 2 5 8 ( l g )
or (Sigma # C - 1 7 6 8 ) ;
4.8 m g / 2 0 ml HzO distillée, filtrée à 0 . 2 2 ^ m ; Aliquotes 1 ml eppendorf
-Supplément B - 2 7 ( 5 0 X ) (Gibco # 1 7 5 0 4 - 0 4 4 ) ; Aliquotes 2 ml
- B S A ( 3 0 0 m g / m l ) (Sigma # A - 9 5 7 6 ) ;
B S A fraction V (solution 3 0 % ) ; Aliquotes 1 ml eppendorf
- L - C y s t é i n e ( 1 0 0 x) (Sigma # C - 2 5 2 9 re m plac é par C 7 4 7 7 ) H y d r o c h l o r i d e a n h y d r e ; stable sous forme de p o u d r e pendant 24 mois
4 2 m g / m l eau distillée, filtrée à 0 . 2 2 u m ; -200 fui eppendorf aliquotes
- D N A s e 1 ( 2 0 K unités/ml) (Sigma # D - 5 0 2 5 ) , type IV, à partir de pancréas de b o v i n s ;
150 0 0 0 unités dissoutes d a n s 7.5 ml d ' e a u distillée, filtrée à 0.22 \im;
Il se peut que la dissolution ne soit pas parfaite (cela dépend du lot) mais l'enzyme ne sera pas affectée, centrifuger le matériel non dissout Aliquotes 1 ml eppendorf
- G l u c o s e (2()0mg/ml) (Gibco # 1 5 0 2 3 - 0 2 1 ) ;
40 g/200 ml eau distillée, filtrée à 0 . 2 2 u m ; Bouteille de 200 ml
- H B S S ( 1 0 x) ( G i b c o # 1 4 1 8 5 - 0 5 2 ) ;
(sans Ca27Mg2 + /NaHC03,/Phénol rouge) 10 ml de p h é n o l rouge ajouté par bouteille de 500 ml
- H B S S ( 1 0 X ) (Gibco # 1 4 0 6 5 - 0 5 6 ) ;
(avec Ca27Mg: + sans NaHC03/ Phénol rouge) 10 ml de p h é n o l rouge ajouté par bouteille de 500 ml
- H B S S / N a H C O V E D T A (6.67 x) 80 ml H B S S 1 0 X (sans Ca27Mg27NaHC03)
N o t e : la concentration peut varier selon les lots.
-Pen/Strep/P v r u v a t e / G l u c o s e : ( 4 0 x)
10 ml pen/strep (see plus bas) 10 ml glucose ( 2 0 0 m g / m l stock)