Le Médiateur de Saccharomyces cerevisiæ

La transcription basale est définie in vitro, par l’activité de Pol II en présence des facteurs généraux. Cependant ce système est incapable de répondre aux signaux de régulation. Ceci à servi de base à la recherche de facteurs qui stimulent la transcription en présence d’activateurs à partir d’extraits protéiques de S. cerevisiae (Kornberg, 2005).

IV.1.1 Découverte et caractérisation du Médiateur

La notion de Médiateur est née au début des années 90 grâce aux phénomènes d’interférence entre activateurs (Kelleher et al., 1990). La transcription d’un rapporteur in

vitro, est activée par un activateur qui se lie en amont du site d’initiation. Si on ajoute un

activateur qui n’a pas la capacité de se lier au promoteur du rapporteur, la transcription du rapporteur est diminué. Une telle interférence a été attribuée à la séquestration par l’activateur non lié à l’ADN d’un facteur requis pour la transcription activée présent en quantité limitante. Une fraction protéique dont l’addition à la réaction annule l’interférence, a été purifiée à partir d’un extrait brut de levure et est à l’origine de la notion de Médiateur (Flanagan et al., 1991).

Une étude génétique menée en parallèle est venue renforcer cette idée. Un groupe de gènes identifiés comme des suppresseurs extragéniques d’une troncature du CTD de Pol II appelé SRB pour « Suppressor of RNA polymerase B », a pu être isolé : MED20 (SRB2),

MED17 (SRB4), MED18 (SRB5), MED22 (SRB6), MED21 (SRB7), MED1 2(SRB8), MED13

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purifiées au sein d’un complexe qui lie le CTD et qui favorise l’initiation de la transcription

in vitro (Hengartner et al., 1995; Nonet and Young, 1989; Thompson et al., 1993).

Indépendamment, le Médiateur a été purifié à homogénéité et caractérisé in vitro (Kim et al., 1994). Les grandes activités du Médiateur ont pu être déterminées, il permet l’activation de la transcription par Pol II en réponse aux activateurs, il stimule la transcription basale dont le niveau augmente en sa présence et il favorise la phosphorylation du CTD par TFIIH.

IV.1.2 Organisation et structure du Médiateur de S. cerevisiae

L’identification des protéines du complexe Médiateur a montré qu’il était composé de 24 sous-unités (Kornberg, 2005). Récemment, une 25ème _{sous unité a été découverte}

simultanément dans notre laboratoire et celui de Claes Gustafsson (Guglielmi et al., 2004; Linder and Gustafsson, 2004). Les protéines du Médiateur de S. cerevisiae sont nommées Med1-22, Med31, Cdk8 et CycC (Bourbon et al., 2004).

IV.1.2.1 Les modules du Médiateur

Le Médiateur comporte quatre modules : la Tête, le Milieu, la Queue et le module Cdk8. Ces sous-complexes peuvent être séparés in vitro sous l’effet de mutations ou en fonction des conditions utilisées au cours de la purification biochimique. En présence d’une concentration de 2 M d’urée, la Tête se sépare du Milieu et de la Queue (Lee and Kim, 1998). Dans un mutant de la sous-unité Med14, la Queue se sépare du Milieu et enfin dans un mutant de Med19, le Milieu se sépare du reste du Médiateur (Baidoobonso et al., 2007; Li et al., 1995). Enfin, le module Cdk8 copurifie indépendamment du reste des sous-unités par purification à l’aide de l’étiquette TAP (Borggrefe et al., 2002). Le Médiateur existerait sous deux formes, avec ou sans le module Cdk8 dont l’association avec les autres modules influencerait le rôle de tout le complexe (Andrau et al., 2006; Elmlund et al., 2006; van de Peppel et al., 2005).

IV.1.2.2 Structure du Médiateur de S. cerevisiae

Un modèle du complexe Médiateur associé à Pol II a été obtenue à la résolution de 40 Å (Asturias et al., 1999). Le Médiateur lie Pol II par les modules de Tête et du Milieu et

CHAPITRE IV : LE MEDIATEUR DE LA TRANSCRIPTION PAR L’ARN POL II

englobe l’enzyme en laissant une surface libre importante qui pourrait permettre à d’autres facteurs de s’insérer (Figure 12A). L’obtention de nouveaux modèles a montré que le Médiateur existait sous plusieurs conformations. En effet, le Médiateur isolé, forme une structure compacte qui s’étire lorsqu’il est associé à Pol II. Cette observation est à l’origine d’un modèle où les changements de conformation revêtent une place importante dans l’activation du complexe (Davis et al., 2002) (Figure 12B). Le Médiateur existerait sous deux états, une forme fermée dans laquelle le module de Queue est repliée sur celui du Milieu, et une forme ouverte associée à l’activation du Médiateur dans laquelle le module de Queue se déplie pour laisser place à l’interaction avec Pol II.

Figure 12: Structure du Médiateur.

A) Modèle structural de microscopie électronique du Médiateur associé à Pol II à la résolution de 35 Å..

B) Changement de conformation observé par microscopie électronique du Médiateur libre ou associé à Pol II.

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IV.1.2.3 Organisation du Médiateur de S. cerevisiae

L’organisation du Médiateur a été définie grâce aux modèles structuraux. En se basant sur les données de biochimie et sur la masse estimée des modules, une organisation en sous-unité a été déduite (Dotson et al., 2000). Des travaux de co-immunoprécipitation de protéine (Kang et al., 2001) et la définition d’une carte à haute résolution déduite de cribles double-hybride sont venus ensuite confirmer et préciser l’organisation du complexe (Guglielmi et al., 2004) (Figure 13). Le module de Tête est composé de huit protéines (Med6, 8, 11, 17, 18, 19, 20 et 22). Il interagit avec le module du Milieu (Med1, 4, 5, 7, 9, 10, 21 et 31) via l’interaction entre Med17 et Med21. Le module de Queue qui est composé de cinq protéines (Med2, 3, 14, 15 et 16), pourrait se replier sur le module du Milieu grâce à l’interaction entre Med3 et Med21. Enfin, le module Cdk8 vient s’ajouter au reste du complexe, il est composé de quatre sous-unités (Med12 et 13, Cdk8 et CycC). Il pourrait s’associer grâce à l’interaction entre Med13 et Med17 aux autres modules (Guglielmi et al., 2004) (Figure 13A).

Figure 13: Organisation du Médiateur.

A) Carte des interactions entre les sous-unités du Médiateur (Guglielmi et al., 2004).

B) Schéma de l’organisation du complexe Médiateur défini par double-hybride (Guglielmi et al., 2004).

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