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Annexe 1 : Le questionnaire:
Etude DNIDMTHFR Date : №
Nom :……… Prénom……… Sexe : Age : Poids : Taille : Tour de taille : Situation familiale Marié (e) : Célibataire : Autre :
Niveau d’étude : Primaire : Secondaire : universitaire : Autre :…...
Fonction : ………..
Origine ethnique :
Autres :……….
Fumeur : Nbre/J : Café : Nbre/J :
Chique : Alcool : Tension artérielle : Systolique : Diastolique : Contraceptifs : Types de contraceptifs :……….
Age de diabète : Pathologies associées : Antécédents Personnels Antécédents Familiaux Diagnostic :………
Examens complémentaires :………
Traitements : ……… Chol :…TG :…HbA1c : µAlb :… Hcy : …Glycémie : …Autre :
A
Oui Non
Oui Non
Oui Non
Annexe 2:
-Les valeurs normales du bilan lipidique Cholestérol 1.50-2.10 g/l Triglycérides 0.70-1.50 g/ C-HDL > 0.38 g/l C-LDL < 1.30 g/
-les valeurs normales de l’Homocysteine: 5 – 15 μmol/L. -les valeurs normales de la glycémie : 0,75-0,85 g/l
-les valeurs normales de la micoalbuminurie : normoalbuminurie < 30µg/mg de Créatinine.
-valeurs normales de l’HbA1c : <6%
-Les étapes de l'extraction de l'ADN : 1- Préparation des leucocytes
-Dans un tube Falcon de 50 ml ; mettre le sang total (7-10 ml) et compléter à 45ml avec du TE 20 :5. Laisser 10 min dans la glace.
- Centrifuger 15 min à 3900 g (3900 rpm).
- Déverser le surnageant prudemment afin de garder le culot leucocytaire précipité au fond de tube.
- Rajouter le TE 20:5 au culot jusqu’à 25-30 ml, agiter pour le remettre en suspension et laisser 10 min dans la glace.
- Centrifuger dans les mêmes conditions précédentes.
- Déverser le surnageant : obtention d’un culot de leucocytes.
(Si on s’arrête à ce niveau, les mettre dans un tube nunc de 15 ml avec du TE 10 :1 et les conserver à -20°C dans un congélateur).
2- Extraction de l’ADN - Décongeler les leucocytes.
-Centrifuger pendant 15 min à 3900 rpm
- dilacérer le culot de leucocytes soigneusement afin de les prendre complètement et les mettre dans un tube Falcon conique de 15 ml.
- Ajouter 3 ml de tampon de lyse (Na Cl 400 mM,EDTA 2mM,Tris 10mM,PH 8.2) -Ajouter 200 μL de SDS à 10% (100 g SDS + 1000 ml H2O)
-Ajouter 100 μL de protéinase K (PK) à 10 mg / ml.
-Ajouter 1 ml de Na Cl 4 M et agiter rigoureusement à la main.
- Remettre 5 min dans la glace (précipitation des protéines). -Centrifuger 15 min à 2500 rpm.
-Transvaser le surnageant dans un tube Falcon de 50 ml, ajouter 2 fois son volume
d’éthanol absolu (100%) préalablement refroidi et agiter en tournant le tube plusieurs fois : la formation de la méduse visible à l’œil nu. (Laisser éventuellement 30 min à –20°C si la pelote d’ADN ne se forme pas).
- Récupérer la pelote d’ADN par une pipette pasteur et la rincer 2 fois dans l’éthanol à 70% dans un tube nunc (eppendorf) stérile.
3-Solubilisation de l’ADN :
- L’ADN est réhydraté en ajoutant entre 300 et 1000 μLde TE 10 :1 selon la grosseur de la pelote et la concentration souhaitée.
- Laisser une nuit sur agitateur rotateur à 37°C, puis à température ambiante jusqu’à dissolution complète (de 1 jusqu’à 3 jours).
• Pour la réextraction de l’ADN, dans le cas où il est contaminé (par des protéines ou par un ARN), ajouter à la solution d’ADN, 200 µl SDS et 200 µl PK, agiter et laisser dans la roue à une température de 37°C pendant 7 jours, puis déterminer la DO de cette ADN.
Annexe 3
Tableau 18: Préparation du milieu réactionnel du PCR pour MTHFR
PCR MIX quantité H2O 35,2µl Tampon 10 X sans mg cl2 5µl Dntp 2mM 5µl MgCl2 25 mM (1,5 mM) 3µl Oligo F (100 pmol/ µl) 0,2µl Oligo R (100pmol/µl) 0 ,2µl Taq polymérase 0,4µl
X
Nombre
D’ADN
Dans l’ependorft : 2µl ADN + 49 µl Mix ; puis dans le thermocycleur et
appliquer le programme de l’MTHFR.
- Oligo nucléotides utilisés :
Oligo F (forward primer) : 5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3' OligoR (reverse primer) : 5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3'
- Dilutions des solutions mères utilisées
• Oligo F solution mère 268 ,2µl (dilution 1/25)
Oligo F solution fille : 37,28 µl de Oligo F solution mère + 62,72 µl H2O distillé
• Oligo R solution mère 333µl
Oligo R solution fille : 30 µl de Oligo R solution mère + 69,97 µl H2O distillé
• dNTP solution mère
DNTP solution fille : 10 µl de dNTP solution mère + 90 µl H2O • MgCl2 solution mère
50µl MgCl2 + 50µl H2O distillé
Tableau 19: Déroulement des cycles de la PCR dans le thermocycleur (ref :
TECHNE GENIUS) Nombre de
cycles Étape Température (°C) Durée
X 1 Dénaturation 94 5 min Dénaturation 94 30s Hybridation 65 30s X 30 Elongation 72 40s 72 10 min 4 5min-24 h
Annexe 4
Tableau 20: préparation du milieu de digestion par l'enzyme Hinf I