Mécanismes d’action

L’action du rituximab est liée à la présence de l’antigène CD20 sur les lymphocytes B. Il y a en effet une diminution du nombre de molécule CD20 à la surface de ces cellules parallèlement à l’augmentation des concentrations du rituximab dues aux doses répétées.

La liaison du rituximab sur le CD20 initie une cascade de signaux intracellulaires. Les molécules de CD20 forment des dimères qui s’associent aux radeaux lipidiques après fixation du rituximab.

Les mécanismes d’action du rituximab ne sont pas complètement élucidés à ce jour mais des études in vitro ont pu en mettre certains en évidence:

- Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) - Cytotoxicité dépendante du complément (CDC)

- Apoptose

4.1. ADCC

L’ADCC est un mécanisme impliquant la liaison de la portion Fc de l’anticorps au récepteur Fc exprimé à la surface des cellules immunitaires cytotoxiques telles que les cellules NK (natural killer), les monocytes et les granulocytes. Ces cellules vont conduire à la destruction du complexe rituximab-cellule B soit par phagocytose soit par la libération de granules cytotoxiques contenus dans ces cellules immunitaires (Cartron G. et al, 2004 ; Manches O. et al, 2003 ; Smith M.R., 2003).

Les cellules effectrices agissent, après liaison de la portion Fc de l’IgG du rituximab sur leur récepteur spécifique FcR, contre les cellules sur lesquelles sont liés les Ac afin de les détruire.

Il existe trois types de récepteurs : FcRI ou CD64, FcRII ou CD32 et FcRIII ou CD16. Ils comprennent des récepteurs activateurs tels que FcRIa, FcRIIa, FcRIIc et FcRIIIa qui portent un motif ITAM (immunoreceptor tyrosine-based

activation motif) contenant une tyrosine. Ce motif est phosphorylé lors de la liaison à

l’anticorps ou complexe immun. Il s’ensuit soit une phagocytose, une exocytose de granules toxiques, l’ADCC ou la synthèse de cytokines. Il existe également des récepteurs inhibiteurs tels que FcRIIb qui contiennent des motifs ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif). Ils n’entraînent pas de mort ou de lyse cellulaire mais engendrent l’activation de la cellule B. Selon une étude menée par Clynes et al en 2000, des souris déficientes en récepteur inhibiteur FcRIIb seraient hypersensibles au mécanisme d’ADCC tandis que des souris déficientes en récepteurs activateurs FcRI et FcRIIIa seraient incapables d’arrêter la croissance tumorale in vivo. Ces résultats démontrent que l’ADCC est dépendante des récepteurs FcR et que pour atteindre une efficacité optimale l’anticorps doit se lier de préférence aux récepteurs activateurs (Clynes R.A. et al, 2000).

Figure 4. Structure des différents récepteurs FcR (d’après Cartron G., 2007)

Le motif ITIM est représenté par un cylindre rouge et confère au FcRIIb ses propriétés inhibitrices. Les motifs hexagonaux bleus représentent le motif ITAM qui permet aux autres FcR d’avoir des propriétés activatrices. On distingue par ailleurs des récepteurs de haute affinité pour les IgG (FcγRI)

avec trois domaines extra-cellulaires et des récepteurs de faible affinité pour les IgG (FcγRII et FcγRIII) possèdant deux domaines extra-cellulaires.

Ce mécanisme nécessite donc le recrutement des effecteurs cellulaires de type NK ou macrophagique et l’interaction récepteur FcR présent à la surface des cellules. Les travaux de Cartron et de son équipe ont montré qu’il existe un lien entre le génotype FCGR3A et la réponse au rituximab. En effet ce gène dimorphique code pour des récepteurs FcRIIIa avec soit une phénylalanine (F) soit une valine (V) en position 158. Ce résidu interagit directement avec la région charnière inférieure d’IgG1. Il semble que l’allotype 158 V possède une plus forte affinité pour l’IgG1 humaine que l’allotype F et augmente ainsi l’ADCC. Le génotype homozygote FCGR3A-158 V apporte de loin une meilleure réponse au rituximab que l’homozygote 158-F ou l’hétérozygote. Les cellules NK et les macrophages portent le récepteur FcRIIIa. Ainsi les patients homozygotes 158V ont une meilleure ADCC. Ce polymorphisme n’a cependant pas été confirmé dans les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC), ce qui implique que l’ADCC n’est peut être pas valable pour tous les types cellulaires (Cartron G. et al, 2002 ; Farag S.S. et al, 2004 ; Hatjiharissi E. et

al, 2007 ; Koene H.R. et al, 1997)

En 2008, Cartron et al ont démontré que le facteur de croissance GM-CSF augmente l’activité du rituximab (pour mémoire). Le GM-CSF est une glycoprotéine sécrétée par les macrophages, les lymphocytes T, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Il favorise la prolifération des cellules myéloïdes et leur différenciation. Il favorise la transformation des cellules souches en CFU-GEMM (colony-forming unit

granulocyte/erythrocyte/megacaryocyte/monocyte) puis la transformation de ces

derniers en thrombocytes, polynucléaires neutrophiles, monocytes, macrophages, éosinophiles et basophiles. Ce facteur de croissance intervient dans la fabrication de nouvelles cellules et de nouveaux tissus tout particulièrement après une lésion à n’importe quel endroit de l’organisme. Il est utilisé pour accélérer la récupération du système myéloïde après une transplantation de moelle osseuse et pour traiter les leucopénies induites par les chimiothérapies. L’équipe de Cartron a donc mené une étude clinique de phase II sur l’association du rituximab et du GM-CSF chez des patients atteints d’un lymphome folliculaire en rechute ou en progression. Cinq g/kg/jour de GM-CSF ont été données pendant 8 jours. Le rituximab était administré le 5^e jour à la posologie de 375 mg/m². Les cycles étaient répétés aux 21 jours pour un total de quatre. Les auteurs ont observé 70% de réponse objective dont 39% de

réponse complète et 25% de réponse partielle. Ils ont également comparé le nombre de cellules présentes dans le sang périphérique avant et après chaque cycle. L’association rituximab et GM-CSF augmente significativement le nombre de neutrophiles, d’éosinophiles et de monocytes. Ainsi cette combinaison active les cellules immunitaires, particulièrement les granulocytes et les monocytes, qui expriment les récepteurs FcRIIIa et FcRIIa et qui sont impliquées dans le mécanisme d’ADCC du rituximab. Le facteur de croissance renforce ainsi l’efficacité du rituximab par l’augmentation du taux de réponses complètes par rapport à l’utilisation du rituximab seul chez les patients atteints d’un lymphome folliculaire en rechute ou en progression. Cette combinaison devrait être étudiée de plus près et pourrait être utilisée pour d’autres formes de LNH de bas grade (Cartron G. et al, 2008).

Il existe un lien entre le mécanisme d’ADCC et la CDC. En effet, les molécules provenant de l’activation de la cascade du complément telles que C3b, iC3b, C4b, viennent se fixer sur la cellule cible. Les cellules effectrices qui possèdent des récepteurs pour les fractions du complément vont alors lyser ces cellules cibles. Ces cellules tueuses impliquées sont les cellules NK (récepteur CD11c/CD18) et les macrophages (récepteur CD11b/CD18). Ce mécanisme connu sous le nom de CDCC est aussi favorisé par des anaphylatoxines telles que le C5a, C3a et C4a qui jouent un rôle important dans l’inflammation et dans la défense de l’hôte. Ces anaphylatoxines conduisent à la libération d’histamine et de leucotriènes. Ainsi CDCC pourrait être un mécanisme effecteur mais il est souvent ignoré ou inclus dans l’ADCC (Van Meerten T. et al, 2006 ; Zhou X. et al, 2008).

Figure 5. Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) (d’après Cartron G., 2007)

La fixation de l’anticorps sur sa cible permet le recrutement de cellules effectrices par l’intermédiaire de leurs FcγRs. L’activation cellulaire induite par cette fixation va conduire à la lyse cellulaire (ici la

4.2. CDC

Il s’agit du mécanisme déclenché après l’activation des fractions du complément en présence du fragment Fc provenant de l’IgG1 du rituximab. Le système du complément est constitué d’un ensemble de protéines plasmatiques participant à la destruction des corps étrangers. Les protéines sont produites sous forme inactive et l’activation se fait par clivage ou homopolymérisation. La nomenclature de ces protéines est particulière. Elles sont désignées par un C majuscule suivi d'un numéro donné arbitrairement selon l'ordre de leur découverte. Ce doublet de caractères peut être suivi de la lettre b pour désigner le grand fragment de la protéine clivée ou par la lettre a pour le petit fragment. L’activation du complément peut se faire par trois voies différentes aboutissant toutes à la destruction de la cellule par le complexe d’attaque membranaire (MAC : membrane

attack complex) (Cartron et al, 2004) :

- la voie classique : Elle est activée par le complexe antigène-anticorps. Seules les IgG1, IgG3 et IgM sont capables d’entraîner la cascade des événements de cette voie. L'IgG1, une fois fixée à la surface d’un micro-organisme, passe alors d'une forme inactive à une forme active laissant ainsi apparaître ses Fc (fragments constants). C1 peut alors se fixer au Fc ce qui l'active, et permet l'hydrolyse de C4 en C4b (et C4a) qui se fixent par covalence à l'Ag (antigène). C1 clive aussi C2 et C2b se fixe à C4b formant le complexe C4b2b (ou C4b2a selon la littérature) nommé aussi C3 convertase de la voie classique. Il y a alors hydrolyse de C3 et production de C3b qui se lie au pathogène par liaison covalente ou à C4bC2b formant un nouveau complexe C4b2b3b qui est la C5 convertase. La phase effectrice peut alors commencer.

- la voie alterne : La protéine C3 est circulante dans le plasma ; c'est la protéine la plus abondante système. Elle s'hydrolyse spontanément mais ses produits sont instables et ne peuvent généralement donner lieu d'eux-mêmes à une initiation du système du complément, sauf lorsqu'un des

produits de cette hydrolyse, le C3b, peut se fixer sur un pathogène par liaison covalente avec une protéine ou un polysaccharide. Le fragment Bb issu de l'hydrolyse du facteur B par une protéase plasmique vient se fixer à C3b (lui même fixé au pathogène). Ce complexe C3bBb est nommé la C3 convertase de la voie alterne, car il permet l'hydrolyse d'autres molécules de C3, permettant ainsi la production importance de C3b et de C3bBb. D'autres molécules de C3bBb vont se fixer à des molécules de C3b formant le complexe C3bBb3b qui est une C5 convertase. La C5 convertase a pour fonction de dégrader la protéine C5 et par la suite d'initier la phase effectrice.

- la voie des lectines : Cette voie fait intervenir une collectine (coll- car c'est une protéine ayant un motif répété d'acides aminés comme le collagène, et lectine car elle lie les sucres) qui se fixe sur le mannose bactérien. C'est une MBL (mannose binding lectin) dont la structure est identique au C1q, aux résidus de mannose ou N-acetylglucosamine de certains agents pathogènes. Elle active C4 et permet la formation du complexe C4b2b (ou C4b2a selon la littérature). La suite est similaire à la voie classique.

Ces trois voies du complément conduisent toutes à l’activation de la fraction C3 qui elle-même active la fraction C5. Les phases terminales communes utilisent les fractions C6, C7, C8 et C9.

Figure 6. Les voies du complément (d’après Probst A., 2006)

La voie classique est induite par la liaison du C1q au complexe Ag-Ac. La voie alterne est induite pour sa part par la liaison du C3b aux surfaces activatrices et la voie des lectines par la liaison de la MBL à la surface des agents pathogènes. Toutes ces voies génèrent des C3 convertases (C4b2a ou C4b2b

selon la littérature et C3bBb) responsables respectivement de la formation de C3b et de C5b. Le C3 engendre une C3 convertase et le C3b alimente une étape amplificatrice du C3. Le C5b lié à sa cible

est converti en complexe d’attaque membranaire par une séquence de réactions terminales communes aux trois voies.

Les effets de la CDC sont caractérisés par un gonflement des mitochondries, une dilatation du réticulum endoplasmique rugueux, des altérations du complexe de Golgi et de la membrane plasmatique et nucléaire, et la disparition de l’hétérochromatine conduisant à la production d’espèces réactives de l’oxygène (Bellosillo B. et al, 2001).

Le complément possède trois grandes fonctions :

- l’opsonisation : le fragment C3 du complément vient s’attacher de façon covalente à la surface des bactéries. Les bactéries ainsi recouvertes de C3 sont phagocytées plus efficacement par les macrophages.

- l’inflammation : les fragments C5 (ou anaphylatoxines) se fixent à des récepteurs du complément présents sur les mastocytes et les neutrophiles. Dans le premier cas, cela conduit à la dégranulation des mastocytes. Ces granules contiennent elles-mêmes des molécules pro-inflammatoires telles que l’histamine. Dans le deuxième cas, on a un chimiotactisme (attraction) des neutrophiles vers le foyer infectieux.

- la lyse : les fragments C6-C9 forment le complexe d’attaque membranaire (MAC) qui perfore la paroi et la membrane des bactéries. Ce mode d’action ne nécessite pas l’implication des récepteurs du complément.

La fixation du rituximab à sa cible (le CD20) entraîne la formation d’un complexe immun et conduit à sa redistribution au sein des radeaux lipidiques de la membrane cytoplasmique. Ceci augmente la fixation de la protéine complément C1q à la portion Fc du rituximab. En effet, Cragg et ses collègues ont montré que les Ac anti-CD20 sont particulièrement efficaces pour activer le complément dans le but de détruire les cellules B néoplasiques. Cette activité est fortement liée à la capacité de ces Ac de redistribuer le CD20 vers les radeaux lipidiques membranaires après fixation de l’Ac au CD20. Ainsi, la redistribution de la molécule CD20 est

particulièrement indispensable à la CDC. Le C1q activé va déclencher une cascade lytique entraînant la destruction des cellules cibles par les différentes fractions du complément (Cragg M.S. et al, 2003).

L’accumulation de CD20 dans les radeaux ne change pas la composition des lipides et des phospholipides de la membrane mais rend plus résistants les sphingolipides à un détergent qui habituellement les dissocie (n-octyl-beta-pyranoside). Dans les radeaux lipidiques de cellules lymphoblastoïdes qui expriment une faible quantité de la protéine Cbp/PAG, le rituximab redistribue le CD20 mais ne module pas l’activité des protéines tyrosine kinases. Ceci suggère que la présence de la protéine Cbp/PAG est nécessaire pour la transmission des signaux du rituximab. La redistribution de CD20 rend la protéine de défense du complément CD55 hypersensible aux phospholipases spécifiques de cette protéine. Ainsi le rituximab modifie leur stabilité et leur organisation et régule les voies de signalisation associées et les capacités de défense du complément. Une étude menée par Semac

et al a comparé des radeaux contenant le CD20 avec ceux n’en possédant pas au

niveau de l’activité des protéines kinases, de la composition générale des lipides et du type de phospholipides, du comportement vis à vis de molécules perturbant les radeaux, et de la sensibilité de la protéine de défense GPI-linked CD55 aux phospholipases C et D. Les résultats de l’étude montrent que le rituximab redistribue le CD20 vers les radeaux lipidiques sans en modifier la composition générale mais il augmente la résistance des sphingolipides et de la protéine Cbp/PAG vis à vis de l’OTG. Il régule l’activité catalytique de la kinase Lyn, augmente la sensibilité du GPI-linked et de la protéine de défense du complément CD55 aux phospholipases C et D. Le rituximab redistribue le CD20 dans les radeaux lipidiques et module l’activité de la protéine kinase Lyn. La présence de Cbp/PAG est donc nécessaire pour assurer l’effet du rituximab sur l’activité catalytique de la kinase Lyn associée aux radeaux et ainsi favoriser la CDC (Semac I. et al, 2003).

Smith et ses collègues ont montré que la redistribution du CD20 vers les radeaux lipidiques est indispensable à la CDC. Elle est nécessaire pour activer les étapes précoces des voies d’activation du complément et augmenterait la sensibilité du MAC (Smith M.R. et al, 2003).

La CDC serait en partie associée au nombre de cellules B exprimant le CD20 sur leur membrane. Plus le taux de CD20 est élevé, plus les MAC seront assemblés (Golay J. et al, 2001).

La plupart des protéines du complément régulent l’action des facteurs C1-C9 essentiellement afin d’éviter l’emballement du système et de protéger les autres cellules contre le complément. La cascade du complément peut être inhibée par les protéines de surface CD55 et CD59. Des recherches sur le rôle des inhibiteurs du complément (CD35, CD46, CD55 et CD59) ont montré que CD55 et CD59 sont des régulateurs importants de la CDC dans les lignées cellulaires des LNH folliculaires. En effet, le blocage de CD55 et CD59 par des anticorps spécifiques a augmenté significativement la CDC dans les cellules des LNH folliculaires (Golay J. et al, 2000). CD55 se lie aux C3b et C4b et accélère le déclin des convertases C3 et C5. CD59 se fixe à C8 et C9 et empêche la formation de pores par les complexes d’attaque membranaires, l’étape finale de la CDC. Selon Sibilia et ses collègues, la CDC serait régulée par ces deux molécules et l’étude de leur expression permettrait de prédire in

vitro la réponse clinique au rituximab mais cette hypothèse reste cependant à

confirmer (Sibilia J. et al, 2005).

En plus de la lyse finale par le MAC, l’activation du complément entraîne le dépôt de C3, C3b et des protéines de dégradation du C3b à la surface des cellules. Ces fragments attachés à la membrane pourraient constituer des cibles pour les cellules effectrices portant le récepteur C3, augmentant ainsi la mort cellulaire par ADCC (Cartron G. et al, 2004).

Il semblerait que l’activation du complément soit responsable de certains effets indésirables du rituximab. En effet, Van Der Kolk et son équipe ont montré que dans les premières minutes suivant l’administration du rituximab, on observe une augmentation des facteurs du complément en particulier les fractions C3b/c et C4b/c ainsi que le TNF alpha. Il semble que ces fractions du complément activées agissent comme des anaphylatoxines (Van Der Kolk L.E. et al, 2001). Une étude menée par Bienvenu et al confirme l’augmentation du TNF alpha en présence du rituximab. En

effet, ils ont comparé le traitement CHOP seul et celui associant le rituximab ; l’association CHOP + rituximab augmente le taux de TNF alpha (Bienvenu J. et al, 2001). Tawara et son équipe ont également prouvé l’idée que la CDC serait responsable des effets indésirables observés. En effet, ils ont réduit l’activité de leur anticorps HD8 chez les singes et les rats en modifiant la région Fc. Ils ont substitué les résidus 332 (lysine) et 331 (proline) nécessaires à la liaison du C1q et ont observé une diminution de la CDC et aucun effet indésirable n’est survenu suite à la perfusion. L’apparition des effets toxiques seraient donc en majeure partie liée au complément (Tawara T. et al, 2008).

Figure 7. Cytotoxicité cellulaire dépendante du complément (CDC) (d’après Cartron G., 2007)

La liaison de l’anticorps à sa cible permet l’activation de la voie classique du complément via la fixation de C1q sur la portion Fc de l’anticorps. Ceci aboutit à la production de C3b qui va permettre d’activer la phase terminale et lytique (C5-C9) à l’activation du complément conduisant à la formation du complexe d’attaque membranaire (MAC) et à la lyse de la cellule lymphomateuse. La libération des

produits de clivage C3a et C5a (anaphylatoxines) va permettre la migration, sur le site d’activation de l’anticorps, de cellules effectrices (monocytes, polynucléaires, cellules natural killer). Ces cellules qui expriment les récepteurs au C3b vont alors être recrutées et exerceront leur activité cytolytique ou de

phagocytose envers la cellule lymphomateuse. CD55, CD46 (DAF : decay accelerating factor) et CD59 présents à la surface membranaire sont des protéines permettant de réguler négativement l’activation du complément en inhibant la phase précoce (complexe C3 convertase ; CD55, CD46) ou

4.3. Apoptose

L’apoptose, ou mort cellulaire programmée, correspond à une autodestruction des cellules lorsqu’elles ne sont plus utiles à l’organisme, c’est-à-dire quand elles sont endommagées ou dysfonctionnelles.

L’apoptose contrôle le nombre de cellules dans les tissus et élimine individuellement les cellules qui pourraient conduire à des états pathologiques. Elle se distingue de la nécrose par le fait qu’elle concerne des cellules individuelles et n’induit pas d’inflammation.

La lyse cellulaire par apoptose se fait en plusieurs étapes : condensation du cytoplasme, du noyau et de la chromatine, fragmentation de l’ADN, bourgeonnement de la membrane plasmique (formation de corps apoptiques). Les corps apoptiques sont ensuite relargués puis phagocytés par les macrophages.

Il existe deux voies apoptiques : la voie mitochondriale, utilisée préférentiellement par le rituximab, et la voie des TNF-R ou Fas. Ces deux voies conduisent à l’activation des caspases (protéines cysteines cytosoliques). Il semble en effet que le rituximab induit l’activation des caspases et plus particulièrement la caspase 3 qui cause le clivage d’une variété de protéines importantes. Cette caspase 3 peut être activée par divers mécanismes incluant la voie impliquant la