Collaboration avec le Dr D. Gopaul, Institut Pasteur Paris: résolution de la structure d’IntSSV en complexe avec l’ADN.
Collaboration avec le Dr Q. She, University of Copenhagen, Denmark: enzymatic properties of integrases from fuselloviruses.
Les résultats que nous avons obtenus en étudiant des mutants du site actif ouvrent de nouvelles perspectives quant à l’étude du mécanisme de la recombinaison spécifique de site. Ainsi nous sommes actuellement en train de tester notre modèle de site actif partagé en construisant de nouveaux mutants d’IntSSV
. En effet, ce modèle pourrait être renforcé si certaines prédictions sont vérifiées. Par exemple, on peut s’attendre à ce qu’un double mutant Arg211Leu-Arg240Leu soit toujours complémenté par le mutant Tyr314Phe, alors qu’un double mutant Arg240Leu-Tyr314Phe ne le sera pas (Figure 24). Par ailleurs, j’espère pouvoir obtenir prochainement des informations sur la structure d’IntSSV
. J’ai développé des susbstrats symétriques, et testé les propriétés de fixation d’IntSSV
sur ces sites ainsi que sa capacité à les couper. Nous pouvons utiliser deux substrats, l’un de 27 pb l’autre de 33 pb, dans les essais de cristallisation. L’utilisation de tels substrats permettra d’améliorer la résolution de la structure de l’ADN dans les co-cristaux, et permet également d’augmenter les conditions d’obtention de structures cristallines.
Nous n’avons toujours pas réussi à reproduire la réaction de recombinaison in vitro. Si l’hypothèse du partenaire protéique manquant est correcte (voir paragraphe 3), IntSSV
devrait malgré tout présenter une activité de résolution des jonctions de Holliday. De telles structures sont en effet des intermédaires réactionnels naturels des réactions d’intégration et d’excision. J’ai donc modélisé des oligonucléotides permettant de créer une jonction de Holliday par hybridation. Le marquage
Figure 25: Structure des plasmides rapporteurs de recombinaison.
Des plasmides portant différentes orientations relatives des sites attB et a t tP sont construits pour tester l’activité d’IntSSV. Les deux types de construction portent l’origine de réplication de p15a et un gène de résistance au chloramphénicol.
A: Les sites attB et attP encadrent le gène lacZ sous contrôle de son propre promoteur. Le gène lacZ est présent dans
l’une ou l’autre des orientations indiquées. Les différentes combinaisons possibles des sites de recombinaison et du marqueur phénotypique conduisent à huit plasmides différents. Selon l’orientation relative des sites attP et attB, un événement de recombinaison conduira soit à l’inversion de la région qu’ils délimitent, soit à l’excision de cette région. Dans ce cas, les bactéries transformées par les produits de recombinaison auront un phénotype Lac-.
B: Les sites attB et attP encadrent un terminateur fort de transcription localisé entre un promoteur et le gène rapporteur
(ici lacZ). Un événement de recombinaison conduira à l’excision du terminateur, et donc à l’expression du gène rapporteur.
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-alternatif de chacun des quatre brins permettra de suivre les produits de la réaction. L’analyse de la taille des oligonucléotides en fin de réaction nous indiquera si IntSSV
a résolu la structure, et plus précisément quel type d’échange de brin a été réalisé. Le retour aux sites parentaux, mimerait la réaction d’excision, alors que la production des sites recombinants traduirait l’intégration. De nombreuses recombinases à tyrosine sont actives sur de tels substrats, et c’est ce type d’activité qui a permis de révéler que les recombinases XerC et D étaient fonctionnelles in vitro (Arciszewska & Sherratt, 1995). Une autre hypothèse non exclusive concernant l’absence d’activité de recombinaison d’IntSSV
in vitro, est que les substrats ADN portant les sites attB et attP sont mal définis. J’ai développé des substrats permettant de suivre l’activité de recombinaison dans des tests
in vitro/in vivo ou totalement in vivo en hôte hétérologue. L’avantage d’une étape in vivo est qu’elle
devrait permettre de détecter des évènements intervenus à une faible fréquence à condition que la sélection phénotypique soit suffisamment sensible. Les plasmides rapporteurs d’activité seront incubés in vitro en présence d’intégrase, et les produits de la réaction utilisés pour transformer E.
coli. La première génération de ces plasmides rapporteurs utilise le gène lacZ comme marqueur
phénotypique (Figure 25 A). Les essais préliminaires ont montré la limite de ce système qui consiste à chercher des clones Lac
parmi des Lac+
. La deuxième génération que nous allons construire permettra de rechercher des clones Lac+
parmi des Lac
-, ou dans une version à plus haute sensibilité des clones résistants à un antibiotique (Figure 25 B). La version utilisant le gène lacZ sera également utilisée comme rapporteur d’activité dans le projet biotechnologique présenté au paragraphe 5.
Enfin, je viens de démarrer une collaboration avec Qunxin She de l’université de Copenhague. Son équipe étudie le virus SSV2, fusellovirus isolé de Sulfolobus islandicus. Nous souhaitons développer une étude conjointe des intégrases des deux virus, l’étude biochimique étant réalisée à Orsay et l’étude in vivo à Copenhague. Dans un premier temps nous allons construire des protéines chimères composées de la région N-terminale (comprenant le site attP) de l’une et de la région C-terminale de l’autre. Les propriétés des protéines chimères seront étudiées in vitro et in
vivo. Notre hypothèse est que nous obtiendrons une spécificité d’intégration correspondant à
l’origine virale du domaine N-terminal (SSV2 s’intègre spécifiquement dans un gène d’ARNtGly
). S’il s’avère que nous pouvons altérer la spécificité d’intégration, nous construirons de nouvelles chimères permettant de cibler de nouveaux gènes d’ARNt, ne correspondant pas à une intégration naturelle. Notre objectif est de pouvoir ainsi obtenir plusieurs virus recombinants ayant tous une spécificité d’intégration différente. A plus long terme, nous espérons pouvoir cibler d’autres gènes d’intégration que les gènes d’ARNt, ce qui permettrait d’utiliser les fusellovirus comme outils de disruption génique chez les Sulfolobales.