Mécanisme de réparation de la NHEJ classique

La NHEJ classique peut être décrite selon trois étapes distinctes : une étape de reconnaissance, une étape de préparation et une étape de ligation des sites de CDB. La première étape permet le recrutement de protéines de reconnaissance et de préparation de l’ADN endommagé. Suite à cette première étape, les protéines vont alors traiter l’ADN et favoriser la juxtaposition des brins d’ADN libres, facilitant ainsi la ligation constituant la troisième étape de la réparation.

1.3.2.1.1.1 Etape 1 : Reconnaissance des CDB

Suite à la survenue de CDB (Figure 7A), les extrémités libres de l’ADN sont reconnues par le complexe hétérodimérique Ku70-Ku80 (Jeggo et al. 1999) qui va alors recruter la sous-unité catalytique DNA-PKcs (Figure 7B) (Chan et al. 2002; Calsou et al. 2003). Suite à la formation du complexe DNA-PK, DNA-PKcs va alors être activée par autophosphorylation ou occasionnellement par phosphorylation par ATM et/ou ATR sur des résidus Sérine et Thréonine. Cette activation de DNA-PKcs va faciliter le recrutement et la phosphorylation des enzymes de préparation et de ligation de l’ADN aux sites de dommage (Yajima et al. 2009; B. P. C. Chen et al. 2006). Cette autophosphorylation serait à l’origine d’un changement structural de l’holoenzyme mais permettrait également une régulation fine de l’accès à l’ADN pour les enzymes de préparation de l’ADN (Dobbs, Tainer, and Lees-Miller 2010; Neal and Meek 2011). Par ailleurs, cette autophosphorylation est nécessaire pour la continuation de la NHEJ car elle va entraîner le relargage de DNA-PKcs de l’ADN, permettant ainsi aux autres protéines impliquées dans la NHEJ de procéder (Hammel et al. 2010). Cette régulation pourrait limiter la réparation non sécuritaire des CDB à travers la HR en dehors de la phase S/G2 par exemple (Shrivastav, De Haro, and Nickoloff 2008; Jessica A. Neal and Meek 2011). Plusieurs substrats ont été

identifiés telles que les protéines Ku (Doug W. Chan et al. 1999), Artémis (DNA cross-link repair 1C protein) (Y. Ma et al. 2005), XRCC4 (X-ray repair cross-complementing protein 4) (K.-J. Lee et al. 2004), l’ADN ligase IV (Y.-G. Wang et al. 2004) et XLF (XRCC4-like factor) (YU et al. 2008).

Figure 7. Schéma de l’étape de reconnaissance de la NHEJ. Lors de la survenue d’une CDB (A), celle-ci va

être reconnue par l’hétérodimère Ku70/Ku80 permettant le recrutement de la sous-unité catalytique DNA- PKcs pour former le complexe DNA-PK (B).

1.3.2.1.1.2 Etape 2 : Préparation de l’ADN

Dans des conditions optimales, les extrémités d’ADN libres, alignées, compatibles et possédant un phosphate ou un hydroxyle en 5’ ou en 3’ respectivement, peuvent directement être liguées par la c-NHEJ. Néanmoins, dans des conditions moins adéquates, les extrémités d’ADN nécessitent une préparation à la ligation. En effet, ces bouts d’ADN, produits suite à des irradiations ou après une attaque par des dérivés réactifs de l’oxygène (Reactive oxygen species ou ROS), ne peuvent pas être ligués directement. Ce processus requiert des enzymes supplémentaires pour préparer les extrémités libres de l’ADN. Une de ces enzymes est la protéine Artémis dont l’activité endonucléasique est stimulée par

DNA-PKcs pour éliminer les protubérances issues des extrémités libres simple brin d’ADN nouvellement formées (Figure 8B) (Yunmei Ma et al. 2002). D’autres enzymes de préparation telles que les protéines WRN (Werner syndrome ATP-dependent helicase) (Otsuki et al. 2007; Yannone et al. 2001; Lishan Chen et al. 2003) ou APLF (Aprataxin and PNK-like factor) (Grundy et al. 2013) participent également à la NHEJ.

Figure 8. Schéma de l’étape de préparation de l’ADN lors de la NHEJ classique. Le complexe DNA-PK (A)

Parmi les activités de préparation effectuées lors de la NHEJ, il y a également une étape d’extension réalisée par les ADN polymérases (Figure 8C). Celles-ci sont catégorisées en quatre classes : A, B, X et Y (Burgers et al. 2001). Trois membres de la famille de l’ADN polymérase X sont associés à la NHEJ : ADN Pol-γ, ADN Pol-μ et ADN Pol-TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase). Toutes ces polymérases présentent un domaine BRCT essentiel à la formation d’un complexe entre les membres de la polymérase X et les autres protéines de la NHEJ, aux abords de l’ADN endommagé (Ramsden 2011).

1.3.2.1.1.3 Etape 3 : Ligation des deux brins d’ADN La dernière étape de la c-NHEJ correspond à la jonction des extrémités d’ADN par le complexe ADN/XRCC4/ADN Ligase IV/XLF. En présence des protéines Ku, ce complexe a la particularité de pouvoir liguer deux brins d’ADN issus d’une CDB. Suite au processus de préparation des extrémités libres d’ADN entourant les CDB, les protéines XRCC4, XLF et ADN ligase IV vont former un complexe aux sites de CDB permettant de lier les brins d’ADN (Strande et al. 2012; Mahaney, Meek, and Lees-Miller 2009). Dans un premier temps, XLF, élément essentiel pour l’activité des ADN Pol-γ et Pol-μ, va jouer un rôle dans l’alignement des deux extrémités d’ADN au sein du complexe de ligation, facilitant ainsi le processus de liaison (Figure 9B) (Akopiants et al. 2009). En parallèle, la protéine XRRC4 va interagir avec la protéine PNKP (Bifunctional polynucleotide phosphatase/kinase) (Karimi- Busheri et al. 2007). Cette enzyme bi-fonctionnelle phosphoryle l’extrémité 5’-OH et déphosphoryle l’extrémité 3’-P favorisant ainsi la ligation de l’ADN grâce à une association chimique idéale (Chappell et al. 2002). Par la suite, l‘ADN Ligase IV va interagir avec l’hélice α de la protéine XRCC4 par l’intermédiaire d’une région comprise entre deux domaines BRCT en C-terminal (Q. Wu et al. 2011). Cette liaison va permettre la stabilisation de l’ADN Ligase IV et stimuler son activité ligase (Nick McElhinny et al. 2000; Grawunder et al. 1998). De plus, des analyses structurales ont suggéré que ce complexe pourrait former une structure filamenteuse facilitant le lien entre les deux bouts d’ADN (Andres et al. 2012, 2007). Ainsi, le complexe XRCC4/ADN Ligase IV participerait, au cours du mécanisme de réparation, au maintien de la stabilité des extrémités d’ADN libres (L.

Chen et al. 2000). Cette fonction de stabilisation, commune à d’autres protéines accessoires, est particulièrement importante pour une réparation complète et sécuritaire des CDB par la c-NHEJ.

Figure 9. Schéma de l’étape de ligation des deux brins d’ADN lors de la NHEJ classique. (A) Suite à la

préparation des extrémités libres d’ADN suivie de l’activité des polymérases, le complexe XLF/XRCC4/ADN Ligase 3 est recruté (B) pour permettre une ligation des deux extrémités d’ADN.

1.3.2.1.2 Mécanisme de réparation de la NHEJ alternative