Índex de taules
Capítol 2: hipòtesi de treball i objectius
3.4 Mètode d’obtenció d’extensions cromosòmiques de l’1CP i de la metafase II (MII) de l’oòcit madur d’hàmster
3.4.1 Obtenció d’oòcits madurs d’hàmster: estimulació ovàrica
Els oòcits s’obtenen després d’una estimulació hormonal de femelles d’hàmster:
— Injecció en el peritoneu de trenta-cinc a quaranta UI/animal d’hormona gonadotrofina d’euga gestant (PMSG, Sigma) el primer dia del cicle. L’acció d’aquesta hormona provoca la maduració sincrònica d’un nombre d’oòcits elevat.
— Injecció en el peritoneu de trenta-cinc a quaranta UI/animal d’hormona gonadotrofina coriònica humana (hCG, Lavet), entre cinquanta-vuit i seixanta hores més tard de la injecció de PMSG.
L’acció d’aquesta hormona aconsegueix la superovulació dels oòcits madurats.
3.4.2 Recuperació d’oòcits madurs d’hàmster
Després de setze–disset hores de la injecció de l’hCG, la femella s’anestesia amb èter etílic i se sacrifica per dislocació cervical. En aquest moment els oòcits madurs superovulats es troben dins del cúmul situat a l’ampul·la de cada oviducte.
Es dissecciona l’ampul·la de cada oviducte i es posen en plaques de cultiu estèrils (Nunc o similar) amb medi BWW3 [vegeu l’apartat 3.2] gasificat en una atmosfera de 37ºC, 5 % CO2, i 95 % d’humitat.
Tots els passos següents es fan sota control d’un estereomicroscopi. El cúmul s’obté introduint, amb xeringa i agulla, un mil·lilitre del mateix medi en un extrem de l’ampul·la. Per pressió positiva el cúmul s’expulsarà per l’altre extrem [figura M-1].
Figura M-1. (a): ovari d’hàmster estimulat. (b): introducció de medi en un extrem de la l’ampul·la de l’oviducte mitjançant una xeringa amb agulla. (c) cúmul fora de l’ampul·la [estereomicroscopi]
El cúmul conté els oòcits madurs i després d’un tractament enzimàtic amb hialuronidasa en medi BWW3
gasificat en una atmosfera de
37ºC, 5 % CO
2i 95 % d’humitat i cobert amb oli de parafina
. La durada del tractament és de dos minuts per tal que els oòcits quedin lliures de les cèl·lules que els envolten [figura M-2].Figura M-2. (a): oòcit madur d’hàmster dins del cúmul. (b): després del tractament amb hialuronidasa. [microscopi invertit amb òptica de Nomarski 200x]
3.4.3 Aïllament de l’1CP d’oòcits madurs d’hàmster
Cada oòcit madur es tracta amb una solució de tripsina en medi BWW3 [vegeu l’apartat 3.2] gasificat en una atmosfera de 37ºC, 5 % CO2 i 95 % d’humitat i cobert amb oli de parafina. La durada del tractament és de dos minuts per tal de dissoldre la zona pel·lúcida (ZP) que envolta l’oòcit [figura M-3].
(a)
(b)
(c)
(a) (b) ZP
1CP
Figura M-3. (a): oòcits madurs d’hàmster sota l’efecte de la tripsina dissolent la ZP. (b): un oòcit després del tractament amb tripsina, en què queden lliures l’1CP i l’MII de l’oòcit [microscopi invertit amb òptica de Nomarski 200x]
L’1CP i l’MII de l’oòcit, lliures de la ZP, es recuperen amb l’ajut d’una pipeta Pasteur estirada al foc.
Ambdues cèl·lules es fixen per separat, cada una en el seu portaobjectes, emprant el mètode desenvolupat per nosaltres, descrit més endavant, per a la fixació de l’1CP i una modificació del mètode de Tarkowski (1966) per a la fixació de l’MII de l’oòcit.
Per aïllar l’1CP també s’ha aplicat una tècnica de micromanipulació sense eliminar totalment la ZP.
L’oòcit es posa en un portaobjectes excavat amb medi BWW3 [vegeu l’apartat 3.2] gasificat en una atmosfera de 37ºC, 5 % CO2 i 95 % d’humitat i cobert amb oli de parafina. L’oòcit madur subjectat amb el micromanipulador es col·loca de manera que l’1CP quedi a la posició equivalent a les tres de les agulles del rellotge. El forat es realitza per dissolució local de la ZP amb una solució d’àcid Tyrode a pH 2. L’àcid es lliura per una pipeta molt fina (< 10 µm de diàmetre intern) directament a la ZP que es vol dissoldre [figura M-4].
Figura M-4. Biòpsia d’1CP d’oòcit madur d’hàmster per dissolució parcial de la ZP mitjançant l’aplicació de solució d’àcid Tyrode.
[microscopi invertit amb òptica de Nomarski 200x]. Vegeu l’annex 1 de l’apartat 7.
(a) (b) 1CP
MII ZP
Sortida d’Àc.
Tyrode
Forat a la ZP
1CP
3.4.4
Obtenció d’extensions cromosòmiques d’1CP d’hàmster3.4.4.1 Tractament previ dels portaobjectes
Els portaobjectes amb banda mat i vores bisellades (Objektträger, Menzel-Glaser) es desengreixen i, una vegada secs, es banyen en una solució de trimetoxisilà [vegeu l’apartat 3.2]. Un cop assecat a l’aire es retira l’excés de producte fregant amb un drap de cotó.
3.4.4.2 Tractament hipotònic i fixació
Per al tractament hipotònic s’empra una solució hipotònica consistent en citrat trisòdic dihidratat [vegeu l’apartat 3.2]. Primerament se submergeix la cèl·lula durant tres minuts en una cubeta amb solució hipotònica, després la cèl·lula es passa a un portaobjectes encara envoltada de solució hipotònica i es manté en aquestes condicions durant dos minuts. Tots el passos es fan sempre sota control d’un estereomicroscopi a 50 augments. L’estereomicroscopi disposa de camp fosc i de camp clar (Leica) per facilitar en tot moment la localització de l’1CP.
Per a la fixació s’empra una solució fixadora consistent en àcid acètic i etanol [vegeu l’apartat 3.2]. L’àcid actua eliminant proteïnes i fa que la membrana i el citoplasma desapareguin, mentre que l’alcohol fixa la cromatina. L’augment de la proporció d’àcid acètic, respecte de la proporció 1:3 de la clàssica solució fixadora de Carnoy, aconsegueix eliminar la membrana citoplasmàtica de l’1CP més fàcilment.
La solució fixadora s’aplica un cop ha passat el temps de tractament hipotònic, deixant-la lliscar molt suaument sobre el portaobjectes amb l’ajut d’una micropipeta automàtica, i realitzant moviments suaus en direcció a l’1CP, creant un flux continu en una sola direcció. L’1CP va quedant adherit mentre el fixador va desplaçant, de mica en mica, la solució hipotònica que l’envolta. Quan l’1CP queda cobert únicament de solució fixadora, es repeteix la mateixa operació per segona vegada. Posteriorment en observar, en la zona que hi ha l’1CP, un puntejat, es deixa caure una última gota de solució fixadora des d’una alçada de set o vuit centímetres aproximadament, per tal d’augmentar l’extensió dels cromosomes [figura M-5].
Figura M-5. Esquema del mètode d’aplicació de la solució fixadora sobre l’1CP envoltat de solució hipotònica.
3.4.5 Extensions cromosòmiques de l’MII dels oòcits d’hàmster
L’MII de l’oòcit es tracta amb una solució hipotònica de citrat trisòdic dihidratat a l’1,0 % [vegeu l’apartat 3.2] durant sis minuts, després es col·loca sobre un portaobjectes amb un volum mínim de solució hipotònica. Llavors, amb l’ajut d’una micropipeta automàtica es tira gota a gota la solució fixadora [vegeu l’apartat 3.2], molt a poc a poc i sota control estereomicroscòpic fins que la cèl·lula desapareix, eliminant-se el citoplasma i quedant els cromosomes fixats sobre els portaobjectes (Tarkowski 1966).
3.4.6 Observació i anàlisi citogenètica d’extensions cromosòmiques: tinció uniforme amb colorant Leishman
Les extensions cromosòmiques obtingudes s’observen a microscòpia de contrast de fases (microscopis PROVIS-AX 70 i BX-60, Olympus, Tècniques Mèdiques MAB) a 40 augments. A continuació, les extensions d’1CP d’hàmster s’analitzen mitjançant la tinció uniforme amb colorant Leishman [vegeu l’apartat 3.2] durant sis minuts, després els portaobjectes s’esbandeixen amb aigua corrent i s’assequen a l’aire. Les extensions tenyides s’observen a microscòpia de camp clar (Leitz Diaplan) amb l’objectiu de 100 augments [figura M-6].
Solució hipotònica Solució fixadora
1 CP
Portaobjectes
Figura M-6. Extensió cromosòmica d’una MII d’1CP d’oòcit d’hàmster tenyida amb colorant Leishman. [microscopi de camp clar 1000x]. Vegeu l’annex 1 de l’apartat 7.
Les extensions cromosòmiques es microfotografien amb pel·lícula de blanc i negre (Agfa Copex Rapid AHU 50 ASA), o bé es capturen amb una estació de captura digital i anàlisi d’imatges (Cytovision Ultra, Applied Imaging, Regne Unit; Spectra Vysion, Izasa) acoblades a un microscopi PROVIS-AX 70 i BX-60 respectivament. Es fa una valoració de la qualitat de les extensions dels complements cromosòmics d’1CP i de la morfologia cromosòmica, directament en el monitor o en el paper fotogràfic [figura M-7].
Figura M-7. Extensió cromosòmica d’una MII d’1CP d’hàmster en paper fotogràfic, podem identificar per mida el cromosoma X (el més gran) i el cromosoma 21 (el més petit). [fotografia microscopi de camp clar 1000xl]