Localisation ultrastructurale d’EphA7 dans la région CA1 de l’hippocampe adulte

Les données ont été recueillies dans les trois couches du CA1 (stratum oriens, la couche de cellules pyramidales et stratum radiatum). Les profils cellulaires ont été identifiés selon des critères définis par Peters et collaborateurs (1991).

Dans la couche pyramidale, l’immunoréactivité anti-EphA7 intracellulaire était localisée sur des vésicules et du réticulum endoplasmique. La membrane plasmique des cellules pyramidales était aussi marquée par endroits (Figure 18a). Le même type de marquage (vésicules, réticulum endoplasmique et membrane plasmique) a aussi été fréquemment observé au niveau des corps cellulaires d’astrocytes (Figure 18b).

Des épines dendritiques (Figure 19) et des prolongements astrocytaires, souvent périsynaptiques (Figure 20), ont été les éléments le plus fréquemment marqués.

Plus rarement, nous avons aussi rencontré des dendrites (Figure 21a, b) et des terminaisons axonales (Figure 22a, b) immunopositives. Dans le cas des dendrites, le marquage était essentiellement intracellulaire et concernait des vésicules. La membrane plasmique n’était pas marquée, indiquant que le marquage des dendrites est celui d’EphA7 en transit vers les épines dendritiques.

Figure 18. Immunomarquage anti-EphA7 dans des corps cellulaires neuronaux (cellules pyramidales) et astrocytaires

Micrographies en microscopie électronique montrant l’immunomarquage anti-EphA7 (flèches rouges) dans le cytoplasme (coloré en jaune) du corps cellulaire de deux cellules pyramidales chez la souris (A) ou celui (coloré en bleu) d’un astrocyte de la stratum radiatum chez le rat (B). N : noyau. Barres d'échelle = 500 nm.

Figure 19. Immunomarquage d’EphA7 dans des épines dendritiques

Épines dendritiques (colorées en mauve) montrant une immunoréactivité EphA7 dans certaines vésicules ou appareil épineux, sur la membrane plasmique extrasynaptique et sur les densités postsynaptiques, dans la région CA1. A) et C) Stratum radiatum chez la souris; B) et D) Stratum

radiatum, chez le rat. Noter l’absence de marquage dans les dendrites dont sont issues deux

épines marquée en B et C. Légendes : t, terminaison; d, dendrite; a, astrocyte; é, épine dendritique. Barres d'échelle = 500 nm.

Figure 20. Immunomarquage anti-EphA7 dans des prolongements astrocytaires périsynaptiques.

Noter l’intense immunomarquage de la membrane plasmique dans les petits prolongements astrocytaires (en bleu) localisés au contact d’éléments synaptiques (terminaisons ou épines). A)

S. radiatum, chez le rat. B) S. pyramidale, chez le rat. Légendes: voir Figure 19. Barre d'échelle =

Figure 21. Immunomarquage anti-EphA7 dans des dendrites

Noter l’immunomarquage intracellulaire (flèches rouges) dans des branches dendritiques (colorées en vert). A) S. radiatum, chez le rat. B) S. radiatum, chez la souris. La membrane plasmique n’apparait pas marquée, suggérant qu’il s’agit du marquage de vésicules de transport en transit vers les épines dendritiques. Légendes: voir Figure 19. Barres d'échelle = 500 nm.

Figure 22. Immunomarquage anti-EphA7 dans des terminaisons axonales

Noter l’immunomarquage de sous-populations de vésicules et de la membrane plasmique adjacente (flèches blanches) des terminaisons axonales (colorées en rosé). A) et B) S. radiatum, chez la souris. Légendes: voir figure 19. Barres d'échelle = 500

Discussion

Par hybridation in situ et immunohistochimie en microscopie photonique et électronique, nous avons cartographié la distribution du récepteur EphA7 dans le cerveau du rat et de la souris adultes, de même que sa localisation subcellulaire dans la région CA1 de l’hippocampe, chez les deux espèces. Les deux méthodes montrent une distribution conséquente du marquage. En effet, la distribution régionale du signal d’expression de l’ARNm d’EphA7 détecté par notre ribosonde - qui devrait détecter les 5 isoformes connues d’EphA7 (voir section 2.7.1.) – et celle du signal immunohistochimique avec notre anticorps anti-EphA7 - détectant le domaine intracellulaire des formes de pleine longueur - étaient très comparables, tant chez le rat que chez la souris. De plus l’absence de marquage avec la ribosonde « sens » démontre la spécificité du marquage en hybridation in situ (la spécificité de la séquence de notre insertion, pour EphA7, avait été vérifiée par un « blast » dans Genbank). Bien que nous n’ayons pas été en mesure de tester l’anticorps sur des coupes de cerveau de souris KO-EphA7 (ce que nous souhaitons faire dès que de telles souris nous seront rendues disponibles), la corrélation à peu près parfaite entre les distributions neuroanatomiques obtenues avec les deux approches constitue une preuve convaincante que cet anticorps est bien spécifique en immunohistochimie. Cette corrélation était même manifeste à un niveau sous-régional. Par exemple, dans l’hippocampe, on a pu constater que l’intensité du marquage de la région CA3 était plus faible que dans CA1, autant en hybridation in situ qu’en immunohistochimie. Autre exemple dans le cervelet, où le marquage des cellules de Purkinje était très intense, alors que la couche moléculaire était nettement moins marquée et que la couche granulaire ne montrait aucun marquage avec les deux techniques. Il est bon de se rappeler ici que

cet anticorps est dirigé contre les domaines intracellulaires, SAM et PDZ du récepteur, ne devrait pas détecter donc les isoformes tronquées EphA7-T1 et –T2, qui ne possèdent plus que la portion juxtamembranaire du domaine intracellulaire.

En hybridation in situ, le signal d’expression le plus fort pour EphA7 se trouvait dans l’hippocampe. Il était nettement moins intense dans l’habénula, le striatum, l’amygdale, les cortex cingulaire, piriforme et entorhinal, ainsi que dans le cervelet. Les études de Ciossek et collaborateurs (1995) et de Valenzuela et collaborateurs (1995) sont les seules ayant rapporté auparavant, quoique très succinctement, un motif de distribution neuroanatomique de la transcription d’EphA7 dans le cerveau de la souris adulte, qui était très similaire à nos observations. Dans la présente étude, nous avons aussi démontré que cette distribution est très semblable chez le rat et la souris.

Nos résultats immunohistochimiques en microscopie optique montrent divers niveaux d’expression de la protéine EphA7 dans la plupart des régions anatomiques du cerveau adulte. L’immunomarquage le plus fort a été retrouvé dans l'hippocampe puis, avec des niveaux d'expression moins forts, dans l’habénula, le striatum, l’amygdale, les cortex cingulaire, piriforme et entorhinal, ainsi que dans le cervelet, intense dans les cellules de Purkinje, et plus faible dans la couche moléculaire et dans le noyau olfactif antérieur. L’immunoréactivité était faible ailleurs dans le cerveau. Cela dit, dans son état actuel, notre étude manque encore certains niveaux stéréotaxiques, comme la substance noire, par exemple, qui montrait un niveau d’expression d’EphA7 relativement élevé dans l’étude de Ciossek et collaborateurs (1999).

Ciossek et collaborateurs (1999) ont aussi pu examiner, grâce à des anticorps reconnaissant distinctement les isoformes de pleine longueur (EphA7-TK+) ou tronquée du domaine kinase (EphA7-TK-), la distribution respective de ces deux isoformes. Dans notre étude, l’anticorps utilisé ne détectait pas les isoformes tronquées T1 et T2 d’EphA7, et était donc sélectif pour les isoformes de pleine longueur (EphA7-FL) de même que MDK1-1 et MDK1-2, capables de transduction du signal par l’activité kinase. Possédant aussi les domaines SAM et PDZ, on s’attend aussi à une distribution cellulaire de ces dernières isoformes qui soit semblable à celle de pleine longueur, mais différente de celle des isoformes dépourvues de ces domaines de liaison à d’autres protéines. Dans leur étude, ces auteurs ont, en effet, démontré que les isoformes de pleine longueur et tronquée était distribuées différemment, la forme tronquée restant dans les corps cellulaires alors que celle de pleine longueur migrait dans les prolongements.

Comme suggéré par son expression préférentielle dans les structures clés du système limbique, EphA7 est susceptible d'être impliqué dans les fonctions importantes associées à ce système, notamment les aspects émotionnels du comportement, ou liés à la survie de l'animal et de l'espèce, ainsi que les réponses viscérales qui accompagnent ces émotions. De plus, ce système est généralement reconnu pour son implication dans des processus de formation de la mémoire (Kotter & Stephan, 1997).

Au niveau ultrastructural, nous sommes les premiers à révéler la localisation subcellulaire d’EphA7 en microscopie électronique, en commençant par l’hippocampe adulte. Nous avons jusqu’à maintenant examiné la région CA1 de cette structure anatomique. Nous avons trouvé que l’immunoréactivité d’EphA7 était associée à des vésicules, au réticulum endoplasmique et à

l’appareil de Golgi dans les corps cellulaires. Des observations similaires ont été faites dans les corps cellulaires des astrocytes. Ce marquage intracellulaire est très similaire à celui qui a été rapporté pour EphA4 dans l’hippocampe adulte ou en développement postnatal (Tremblay et al., 2007; Tremblay et al., 2009). Comme dans ces études sur EphA4, nous avons aussi détecté une immunocoloration EphA7 de la membrane plasmique au niveau des corps cellulaires, tant neuronaux qu’astrocytaires. Toutefois, ce marquage de surface des corps cellulaires semblait plus fréquent pour EphA7 que pour EphA4, chez l’animal adulte.

Sa localisation dans les épines dendritiques et les terminaisons axonales des cellules principales de l'hippocampe, suggère un rôle dans les synapses où le récepteur EphA4 a également été situé (Tremblay et al., 2007). Cela dit, EphA4 était beaucoup plus abondant dans les terminaisons axonales qu’EphA7.

Ciossek et collaborateurs (1999) ont indiqué que l'hippocampe montrait une forte immunocoloration pour EphA7-TK+ (pleine longueur) dans le neuropile de toutes ses régions, mais peu ou pas de coloration dans la couche des corps cellulaires, ce qui indique qu'il est transporté le long des neurites. Ce modèle ressemble à celui du récepteur EphB2, qui s'exprime en particulier dans les cônes de croissance (Henkemeyer et al., 1994) et dans la membrane synaptique du cerveau adulte (Torres et al., 1998).

Au contraire, l’immunocoloration d’EphA7-TK- (tronqué du domaine kinase) était évidente dans les couches des corps cellulaire hippocampiques et leurs dendrites proximales, notamment sur les neurones qui exprimaient l’ARNm d’EphA7-TK+,mais peu abondant dans le neuropile. Ces auteurs ont proposé que le récepteur tronqué puisse agir simplement comme un

antagoniste dominant négatif de l’isoforme de pleine longueur, afin d'assurer que celui-ci réponde uniquement aux éphrines rencontrées au niveau des épines ou terminaisons. Cela dit, on peut aussi proposer que le récepteur tronqué serve de ligand pour l’activation d’une éphrine et la transduction inverse du signal (sans transduction antérograde dans le sens du récepteur EphA7).

Dans le cervelet, l’immunohistochimie et l’hybridation in situ ont démontré que EphA7 était localisé surtout dans les corps cellulaires des cellules de Purkinje, les cellules principales du cortex cérébelleux. Parmi les multiples afférences des cellules de Purkinje, les cellules à paniers (« basket cells ») sont celles qui innervent sélectivement le corps cellulaire des cellules de Purkinje (Cesa et al., 2011). Considérant l’hypothèse d’un rôle d’EphA7 dans la formation, le maintien ou la plasticité des synapses, il sera intéressant d’investiguer la possibilité que ce récepteur intervienne dans ces fonctions pour les synapses GABAergiques des cellules à paniers, sur les corps cellulaires de Purkinje. Un examen en microscopie électronique sera effectué pour déterminer la localisation précise de ce récepteur au niveau des cellules de Purkinje. Il sera aussi intéressant d’identifier l’éphrine interagissant avec EphA7 à cet endroit et de déterminer si sa localisation est spécifique à un type d’afférences particulier (ex., cellules à paniers).

Conclusions et directions futures

Nous avons présenté deux études, en hybridation in situ et immunohistochimie, visant à mieux définir la distribution régionale, cellulaire et subcellulaire d’EphA7 dans le cerveau adulte, et plus particulièrement au niveau de l’hippocampe.

Dans le cerveau adulte, EphA7 est transcrit principalement dans l'hippocampe, avec des niveaux d'expression plus modérés ou plus faibles ailleurs. Après l’hippocampe, les niveaux d’expression les plus élevés se trouvaient dans l’habénula, le striatum, l’amygdale, les cortex cingulaire, piriforme et entorhinal, ainsi que le cervelet.

Au niveau ultrastructural, nous sommes les premiers à dévoiler la localisation subcellulaire d’EphA7 en microscopie électronique, ici dans l’hippocampe adulte. Dans cette étude, nous avons examiné la région CA1 et trouvé que l’immunoréactivité d’EphA7 a été localisée dans le cytoplasme et à la surface des cellules principales, granulaires (gyrus dentelé) et pyramidales (CA1 et CA3) et des astrocytes. La localisation au niveau du Golgi, du réticulum endoplasmique ou de vésicules de transport représente manifestement les sites de synthèse, de traitement et de transport de cette protéine. Cependant, sa localisation en surface suggère un rôle d’EphA7 dans des interactions intercellulaires au niveau somatique des neurones et astrocytes; un rôle qui reste à explorer.

Dans le neuropile de CA1, des épines dendritiques et des prolongements astrocytaires, souvent périsynaptiques, ont été les éléments les plus fréquemment marqués, et nous avons rarement rencontré des dendrites ou des terminaisons axonales immunopositives, particulièrement au niveau de leur membrane plasmique. La localisation

préférentielle dans les épines dendritiques et les prolongements astrocytaires périsynaptiques, particulièrement sur la membrane plasmique, est cohérente avec un rôle de ce récepteur dans la plasticité synaptique.

Dans le cadre de cette étude, l’analyse ultrastructurale, en microscopie électronique s’est limitée à la région CA1 de l’hippocampe. Mais, des travaux en cours visent à compléter cette analyse dans les autres régions hippocampiques, de même que dans le cervelet. De plus, dans son état actuel, notre étude manque encore certains niveaux stéréotaxiques, comme la substance noire, par exemple, qui montrait un niveau d’expression d’EphA7 relativement élevé dans l’étude de Ciossek et collaborateurs (1999). Donc il sera nécessaire d’inclure ces niveaux du cerveau dans de prochaines expériences pour bien comprendre le rôle d’EphA7 dans cette région importante du cerveau.

Aussi, dans le cervelet, en considérant l’hypothèse d’un rôle d’EphA7 dans la formation, le maintien ou la plasticité des synapses, il sera intéressant d’étudier la localisation ultrastructurale d’EphA7 dans les différentes régions et couches du cortex cérébelleux, et d’investiguer la possibilité que ce récepteur intervienne dans la fonction des synapses GABAergiques des cellules à paniers, par exemple, sur les corps cellulaires de Purkinje.

Il est important de noter que l’anticorps utilisé dans cette étude, dirigé contre les domaines intracellulaires - SAM et PDZ - du récepteur, ne peut pas détecter les isoformes tronquées EphA7-T1 et –T2 qui ne possèdent plus que la portion juxtamembranaire du domaine cytoplasmique. Pour cela, il pourrait être intéressant de produire un anticorps

capables de détecter sélectivement les isoformes tronquées pour mieux décrire les différences de distribution régionale ou ultrastructurale entre les isoformes tronquées et de pleine longueur du récepteur EphA7 dans le cerveau. De telles données, conjuguées éventuellement avec l’identification des éphrines qui interagissent avec l’une ou l’autre, pourraient permettre de mieux comprendre le rôle distinct ou complémentaire des isoformes.

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