Localisation des Rab GTPases - Trafic vésiculaire et Rab GTPases

C. Trafic vésiculaire et Rab GTPases

5. Localisation des Rab GTPases

Les Rab GTPases sont localisées au niveau de compartiments intracellulaires spécifiques en relation avec leur fonction dans les différents processus vésiculaires. La localisation des Rab dépend de leur prénylation, une modification post-traductionnelle des protéines Rab nouvellement synthétisées et effectuée par une géranylgéranyltransférase qui est aussi une protéine de transport des Rab (REP: Rab escort protein). REP capte les protéines

Figure 7 : Cycle de conversion des Rab GTPases

Une Rab GTPase, nouvellement synthétisée et sous sa forme inactive liée au GDP, est reconnue par une REP (protéine escort des Rab). La REP présente la Rab GDP à la géranylgéranyl transférase (GGT) qui ajoute un groupement géranylgéranyl à l’extrémité C-terminale de la Rab. La Rab-GDP géranylgéranylée est reconnue par un GDI (inhibiteur de dissociation du nucléotide Guanine) qui régule le cycle des Rab au niveau de la membrane.

L’interaction avec un GDF (facteur de déplacement du GDI) permet le recrutement du complexe Rab-GDI à la membrane cible. La conversion de la forme inactive liée au GDP en forme active liée au GTP est catalysée par un GEF (facteur d’échange du nucléotide guanine) qui permet l’échange du GDP en GTP. La Rab GTPase active est reconnue par ses effecteurs et est convertie à sa forme inactive par hydrolyse du GTP qui est stimulée par une GAP (protéine activatrice de GTPase). L’hydrolyse du GTP gènère du GDP et du phosphate inorganique.

54 Rab nouvellement synthétisées et les présente à la géranylgéranyltransférase avant de les délivrer à la membrane appropriée. Une fois que la Rab GTPase est associée à la membrane, un GEF catalyse l’échange du GDP en GTP et donc la dissociation entre une Rab et son REP.

Dans les cellules, les Rab sont localisées au niveau de la face cytosolique des différentes membranes intracellulaires (Figure 8). Rab1 est localisée au niveau du réticulum endoplasmique et le compartiment pré-golgien et assure le trafic entre le réticulum et le Golgi.

Rab2 est localisée au niveau du compartiment intermédiaire pré-golgien et joue le même rôle que Rab1. Rab5, Rab4 et Rab11 sont localisées au niveau des endosomes précoces. Les expériences d’immunomarquage montrent que Rab4, Rab5 et Rab11 sont situés au niveau de la membrane endosomale et forment 3 compartiments: un qui contient exclusivement Rab5, un 2^ème qui contient Rab4 et Rab5 et un 3^ème qui contient Rab4 et Rab11. Le compartiment contenant rab5 et rab4 correspond au compartiment endosomes précoces/endosomes de tri et le compartiment contenant Rab4 et Rab11 correspond aux endosomes de recyclage périnucléaires. La transferrine internalisée se trouve au début au niveau des domaines Rab5, puis dans des structures contenant Rab4 et Rab11. Rab4 et Rab11 peuvent réguler la machinerie de recyclage et de tri de la transferrine (Zerial and McBride, 2001). Rab11 régule le recyclage au niveau des endosomes de recyclage alors que Rab4 régule le recyclage directement à partir des endosomes précoces. Rab6 est localisée au niveau de l’appareil de Golgi et est impliquée dans le transport intra-golgien. Rab7 et Rab9 sont localisées au niveau des endosomes tardifs. Rab9 assure le recyclage des récepteurs du mannose-6-phosphate des endosomes tardifs au réseau trans-golgien. Rab9 a un rôle dans le bourgeonnement à partir des endosomes des vésicules qui seront dirigées vers le trans golgi (Riederer et al., 1994).

Rab7 est associée aux endosomes tardifs (Chavrier et al., 1990), principalement aux lysosomes, qui s’aggrègent et fusionnent aux lysosomes dans la région périnucléaire. Rab7 est essentielle pour l’aggrégation et la fusion des endosomes tardifs avec les lysosomes et donc pour le maintien de la fonction lysosomale. En absence de Rab7 fonctionnelle, les lysosomes seront dispersés au niveau du cytoplasme alors qu’une surexpression de la forme active Rab7 entraîne un élargissement des structures lysososmales. L’expression de dominants négatifs de Rab7 perturbent l’acidification des lysosomes, normalement impliqués dans la dégradation intracellulaire grâce à leurs hydrolases acides (Bucci et al., 2000; Vitelli et al., 1997).

Figure 8: Localisation des différentes Rab GTPases au niveau de la voie de l’endocytose

Rab1 et Rab2 sont localisées à l’interface réticulum endoplasmique (RE) et Golgi. Rab1 assure le trafic du RE vers le Golgi alors que Rab2 assure le transport rétrograde du Golgi au RE. Rab3 est située au niveau des vésicules synaptiques et régule la libération du neurotransmetteur. Rab4 et Rab5 sont localisées au niveau des endosomes précoces (EE) contenant le matériel internalisé. Rab4 est impliquée dans le recyclage direct à partir des endosomes précoces vers la membrane. Rab5 assure la formation des vésicules et leur fusion aux endosomes précoces. Rab11 est localisée au niveau des endosomes de tri et assure le recyclage. Rab6 est localisée au niveau de l’appareil de Golgi et est impliquée dans le transport intra-golgien. Rab8 est localisée au niveau du réseau trans golgien et de la membrane plasmique pour assurer le transport entre ces deux compartiments. Rab7 et Rab9 sont localisées au niveau des endosomes tardifs.

EE: endosomes précoces; LE: endosomes tardifs; ER: réticulum endoplasmique; TGN: réseau trans-golgien

(D’après Stenmark H, Olkkonen VM.Genome Biology 2001, 2(5):reviews3007.1–3007.7)

55 6. Rôle des Rab GTPases dans le système nerveux

Actuellement, le rôle de certaines RabGTPases dans les neurones et les cellules gliales est bien établi en particulier celui de Rab7. (Ng and Tang, 2008). La fonction connue des Rab GTPases dans les neurones et les cellules gliales ainsi que leur localisation est résumée dans le tableau 5.

7. Rab GTPases et maladies

Des expressions aberrantes de Rab GTPases peuvent favoriser la tumorigenèse ou être liées à des maladies héréditaires. D’une manière intéressante, des mutations de Rab7 ont été reportées dans la neuropathie Charcot-Marie-Tooth de type II ulcéro-mutilante (Houlden et al., 2004; Meggouh et al., 2006; Verhoeven et al., 2003). Cette forme de neuropathie est caractérisée par une perte sensitive, une faiblesse musculaire des jambes marquée et une fréquence élevée d’ulcères au niveau des pieds, des infections et des amputations des orteils.

Des mutations de Rab27a sont liées au syndrome de Griscelli de type 2 associé à des défauts immunitaires et qui cause un albinisme partiel. Rab27a régule le mouvement des mélanosomes de la périphérie cellulaire des mélanocytes et l’absence de Rab27a entraîne un défaut de pigmentation dû à une accumulation aberrante des mélanosomes dans les mélanocytes suite à un défaut dans leur transport (Hume et al., 2001; Menasche et al., 2000).

Le syndrome de Griscelli de type 1 associé avec des symptômes neurologiques est dû à des mutations dans le gène codant pour la myosineVa qui est un effecteur de Rab27a. Des mutations de REP1 sont liées à la choroïdérémie, liée à l’X, qui implique une dégénérescence de l’épithélium pigmentaire de la rétine et les couches cellulaires de la choroïde et des photorécepteurs rétiniens entraînant une cécité. La 2^ème isoforme REP2 est suffisante pour la géranylgéranylation de toutes les Rab GTPases dans tous les tissus à l’exception de l’épithélium rétinien alors que REP1 est essentielle pour la géranylgéranylation de Rab27a dans ce tissu (Seabra et al., 2002).

Rab association à la membrane cellulaire/subcellulaire

Fonction impliquée dans les neurones/

cellules gliales Rab2 interface réticulum endoplasmique–

Golgi

adhésion des cellules neuronales et croissance des neurites in vitro Rab3 (A–D) vésicules synaptiques, membrane

plasmique présynaptique

exocytose des vésicules synaptiques;

exocytose dans les astrocytes et les oligodendrocytes

Rab5 endosomes précoces

régulation de la taille des vésicules synaptiques ; endocytose des récepteurs

AMPA; tri endosomal et transport axonal rétrograde

Rab6 Golgi/ trans-Golgi transport de la rhodopsine dans les

photorécepteurs rétiniens

Rab7 endosomes tardifs Tri des endosomes

et transport axonal rétrograde

Rab8 Golgi, vésicules et plis

de la membrane plasmique

transport dendritique polarisé;

transport de la rhodopsine dans les photorécepteurs rétiniens;

trafic des récepteurs AMPA

Rab11 endosomes, synapses

régulation de la sécrétion; transport de la rhodopsine dans les photorécepteurs

régulation possible de la croissance des neurites

Rab22B/Rab31 Golgi/trans-Golgi transport des oligodendrocytes

Rab23 membrane plasmique, endosome

développement du CNS, mutations responsables du syndrome de Carpenter

chez l’homme

Rab24 Limite ER–Golgi, autophagosomes

noyau

Augmentation de l’expression du transcrit dans les motoneurones Tableau 5: Résumé de la fonction connue des Rab GTPases dans les neurones et les cellules gliales ainsi que leur

localisation (d’après Ee Ling Ng, Bor Luen Tang ; B rain R esearch R eviews 5 8 ( 2 0 0 8 ) 2 3 6 – 2 4 6)

IV. Stratégie utilisée

A. Clonage Positionel et cartographie par homozygotie

Dans le cas de maladies récessives dans des familles consanguines, nous utilisons l’approche de clonage positionnel et plus particulièrement la cartographie par homozygotie pour la recherche du gène en cause. En l’absence de données fonctionnelles permettant de cibler un mécanisme particulier, la recherche du gène morbide d’une maladie peut se réaliser de manière indirecte, par clonage positionnel. Le clonage positionnel permet d’isoler un gène à partir de sa localisation subchromosomique sans connaître la protéine pour laquelle il code.

Le clonage positionnel s’oppose à l’approche moléculaire préalable qui permet d’identifier le gène à partir du défaut biochimique ou à l’approche de gène candidat qui se base sur l’observation d’un phénotype similaire entre deux espèces ou sur une famille gènes connus à laquelle le gène appartient (Collins, 1992).

Les études de liaison génétique (cartographie par homozygotie) permettent de lier le gène morbide à une région génomique donnée en montrant la ségrégation de la maladie avec certains allèles des marqueurs de cette région. La cartographie par homozygotie est basée sur l’hypothèse qu’un enfant, issu d’un mariage consanguin et atteint d’une maladie génétique récessive, est homozygote par descendance et reçoit les deux allèles portant la mutation d’un ancêtre commun. Cette mutation pathogène est comprise dans une région d’une dizaine de cM limitée par les recombinaisons produites au cours de la transmission (Figure 9). L’enfant atteint reçoit non seulement la mutation mais aussi des marqueurs polymorphes proches du locus morbide. Les mêmes allèles de ces marqueurs seront partagés par les individus atteints et non par les individus sains. Ceci s’explique par une localisation du gène muté à proximité de ces marqueurs, avec une transmission d’une large région autour de la mutation sur quelques méioses.

Le génotypage de ces marqueurs polymorphes sert à localiser un gène par analyse de liaison génétique. L’analyse de ces marqueurs sur l’ensemble du génome doit être réalisée dans de grandes familles avec plusieurs enfants atteints, afin d’identifier la ou les régions d’homozygotie communes à tous les enfants atteints. Ces marqueurs doivent être suffisamment nombreux, informatifs et espacés pour permettre une bonne couverture du

Figure 9: Principe de la cartographie par homozygotie

Un patient atteint d’une maladie génétique rare et issu de parents consanguins a probablement hérité sur ses deux chromosomes une mutation (étoile jaune) présente à l’état hétérozygote chez un ancêtre commun de ses parents (arrière grand-père sur ce schéma). Les marqueurs polymorphiques localisés dans la région chromosomique autour du gène sont représentés par des ronds de couleurs différentes en fonction des allèles. Du fait des différents évènements de recombinaisons méiotiques (représentées par des croix), les allèles des marqueurs éloignés du gène changent et peuvent donc devenir hétérozygotes chez le patient alors que les marqueurs proches du gène muté sont transmis en bloc à partir de l’arrière grand-père et sont donc à l’état homozygote chez le patient. Ils définissent une région d’homozygotie par descendance (en bleu).

57 génome. Une fois la région candidate minimale déterminée, les gènes localisés dans la région sont séquencés à la recherche des mutations.

A.1. Mesure statistique de la liaison: le LOD score

Les distances génétiques sont le reflet de la fréquence de recombinaison. Plus deux loci (de gènes ou de marqueurs) sont proches, moins ils ont de chance d’être séparés par une recombinaison et plus la distance génétique entre eux sera petite. Lorsque deux marqueurs sont suffisamment proches pour n’être séparés qu’une fois sur 100 gamètes, la distance génétique qui les sépare est définie comme 1 centimorgan (1cM). Il s’agit donc d’une mesure équivalente à 1% de recombinaison. Si deux marqueurs ne sont pas liés (par exemple s’ils sont situés sur deux chromosomes différents), ils seront séparés (en moyenne) une fois sur deux. En conclusion, plus la distance (en cM) entre deux marqueurs est grande, plus la fréquence de recombinaison est élevée avec une valeur maximale de 50% (0,5). Dans le cas de liaison génétique, on peut estimer l'importance de la liaison par le taux de recombinaison ζ, défini comme le rapport: nombre de gamètes recombinants/nombre de gamètes parentaux.

Le LOD (Logarithm of the Odds) score est la mesure de la probabilité de liaison. C’est le logarithme du rapport de la probabilité d’observer une co-ségrégation si les loci sont liés (pour une fraction de recombinaison ζ) sur la probabilité de l’observer en absence de liaison (c’est-à-dire pour une fraction de recombinaison ζ égale à 0,5). Le seuil conventionnel de signification p=0,05 nécessite une probabilité de 1000 chances pour 1 en faveur de la liaison pour pouvoir affirmer celle-ci. Ainsi, un LOD score «Z» de 3 est la valeur minimale généralement admise en faveur de la liaison, avec un risque d’erreur de 5 %. Si Z < - 2 (100 chances pour 1 contre la liaison génétique) on rejette la liaison, si -2< Z<3 on n'a pas assez d'informations pour conclure. Une liaison peut être détectée, en principe par l’étude de seulement quatre enfants d’un couple de cousins germains générant un LOD score de 3.

A.2. Analyse de marqueurs polymorphes du génome

Afin d’identifier les régions d’homozygotie dans les familles étudiées, nous avons procédé à une étude «pangénome » par génotypage de marqueurs SNP chez les atteints nés de parents consanguins. Notre stratégie consiste en l’analyse de tout le génome des atteints d’une même famille afin d’identifier la ou les régions d’homozygotie communes aux atteints. Dans

un deuxième temps, les frères et soeurs sains et les parents sont analysés à l’aide de marqueurs microsatellites au niveau des régions candidates pour tester la ségrégation des haplotypes par rapport aux patients.

A.2.1. Les SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)

Les SNP sont des modifications d’une paire de base le plus souvent caractérisées par deux allèles au sein de la population. Comparés aux autres marqueurs, les SNP présentent l'avantage d'une répartition très dense dans tout le génome. Le taux d’hétérozygotie de chaque SNP est faible. Cependant les technologies d’hybridation sur puce permettent de génotyper de très nombreux SNP chez un même individu et donc d’augmenter l’informativité et de réduire les régions chromosomiques non explorées.

Le protocole expérimental suit les mêmes étapes pour les 4 catégories de puces (10K, 50K, 250K, 900K). Les puces de génotypage sont basées sur un principe d’hybridation allèle spécifique. Pour chaque SNP biallélique, des sondes oligonucléotidiques de 25 pb spécifiques de chacun des 2 allèles, sont fixées sur la puce. L’ADN génomique est digéré est ensuite ligué à un adaptateur qui reconnaît les bouts cohésifs de 4 paires de bases générés par l’enzyme spécifique (Figure 10). Tous les fragments générés par la digestion enzymatique, peu importe leur taille, sont soumis à une ligation. Une amorce générique qui reconnaît les séquences adaptatrices est utilisée pour amplifier l’ADN précédemment digéré et ligué. Les conditions PCR sont optimisées de manière à amplifier des fragments, dont la taille varie entre 200 et 1100 pb, et dans lesquels ont été choisis les SNP présents sur la puce. Les produits d’amplification correspondant à chaque enzyme sont mélangés et purifiés. Après une fragmentation et un marquage à l’aide d’un anticorps anti-streptavidine biotinylée, l’ADN amplifié est hybridé sur la puce. Les étapes de lavage sur la station fluidique et d’hybridation de la puce étaient assurées par la plateforme des puces de notre institut. La détermination du génotype est réalisée à partir de l’intensité d’hybridation au niveau de chaque oligonucléotide spécifique d’un allèle. Chez un individu homozygote pour l’allèle A, seules les sondes spécifiques de cet allèle seront hybridées, et inversement chez un homozygote pour l’allèle B, alors qu’une hybridation sera retrouvée sur les deux types de sondes chez un individu hétérozygote AB. Le génotype de chaque SNP est déterminé par le logiciel fourni par Affymetrix (GeneChip DNA Analysis Software, GDAS, ou plus récemment le GeneChip

Figure 10: Etapes expérimentales de l’étude pangénome par puces de génotypage Affymetrix

L’ADN génomique est digéré avec une enzyme de restriction (XbaI dans le cas des puces 10K); un adaptateur est ligué aux fragments; une PCR avec une amorce complémentaire de l’adaptateur amplifie préférentiellement les fragments XbaI d’environ 250 à 1000 pb qui ont été ciblés par la companie Affymetrix pour contenir les SNPs analysés; l’ADN amplifié est fragmenté; puis marqué et hybridé sur la puce.

(D’après GeneChip® Mapping 10K 2.0 Assay Manual, Affymetrix)

la localisation chromosomique de chaque SNP et les haplotypes de plusieurs individus peuvent donc être comparés. Afin de pouvoir visualiser et comparer facilement les régions d’homozygotie entre différentes familles, Frédéric Plewniak a développé au sein de l’institut un logiciel appelé homoSNP. Ce logiciel correspond à une interface graphique permettant de visualiser les régions pour lesquelles un nombre défini de SNP consécutifs sont homozygotes.

Les régions homozygotes sont représentées en mauve, bleu clair et bleu selon le nombre de SNPs consécutifs homozygotes. Pour une puce 10K, ces couleurs correspondent respectivement à un nombre de SNPs de [15,20[, [20,25[, [25,...[, et pour une puce 50k à [20,25[, [25,30[, [30,...[. Ce logiciel permet aussi de localiser les gènes déjà connus pour une maladie afin de vérifier si des régions homozygotes identifiées ne chevauchent pas avec des gènes ou des loci d’ataxie autosomique récessive connus.

Une version plus récente des puces de génotypage (900K) comporte 906,000 SNP et 946,000 sondes pour la détection des variations du nombre de copies (CNV). Les 906,000 SNP ont été testés sur 500 échantillons d’ADN dont 270 sont des échantillons HapMap.

Approximativement, 482,000 SNP ont été séléctionnés à partir des puces des générations précédentes 5.0 et 500K. Les 424,000 restants sont des TagSNP, des SNP des chromosomes Xet Y et des SNP mitochondriaux. La distance moyenne entre les marqueurs (1,852 million de marqueurs et les CNV) est moins de 700 pb. Chaque SNP est représenté par seulement 3 à 4 sondes avec appariement parfait «Perfect Match». La puce (900K) offre une des meilleures couvertures en CNV. En effet, elle couvre jusqu’à 90,5% des 3400 variations connues du nombre de copies. Un SNP est analysé en moyenne tous les 3,23 Kb et une sonde CNV en moyenne tous les 3,16 Kb. Au total l’information en SNP et CNV est analysée tous les 1,6Kb en moyenne.

En fonction du degré de consanguinité des parents, le nombre de régions homozygotes observées chez les individus atteints sera plus ou moins important. Les descendants de cousins germains ont un coefficient de consanguinité de 1/16; les descendants de cousins au second degré ont un coefficient de consanguinité de 1/64 (1/64ème de leur génome est identique par descendance et donc homozygote) et les descendants de doubles cousins germains ou de demi-frère et demi-soeur de 1/8. Certaines régions sont homozygotes à cause du manque d’informativité des SNP. Ces régions faussement homozygotes peuvent être exclues grâce à l’analyse d’autres marqueurs polymorphes: les microsatellites. L’analyse des microsatellites chez tous les atteints, les parents et la fratrie saine d’une même famille peut aider à réduire la ou les zones d’homozygotie retenues grâce à l’informativité de ces

60 A.2.2. Analyse de Marqueurs Microsatellites

Les marqueurs microsatellites sont des séquences répétées d'ADN composées de répétitions de 2 à 6 nucléotides. Les répétitions (CA)n représentent les marqueurs les plus fréquents dans le génome humain. Ces séquences microsatellites sont présentes sur l'ensemble du génome, le plus fréquemment au niveau des introns des gènes mais également au niveau d'exons. Par un mécanisme de dérapage de la polymérase lors de la réplication, ces séquences ont une tendance relativement fréquente à muter (10^-6 à 10^-2). La longueur de ces séquences, c'est-à-dire le nombre de répétitions, est donc variable d'un individu à un autre et d'un allèle à l'autre chez un même individu définissant le caractère polymorphe de ce type de marqueur. La transmission génétique de ces séquences est mendélienne et l’étude de la ségrégation des allèles dans une famille est possible grâce à une amplification de la séquence répétée par PCR avec des amorces spécifiques l’encadrant. Chaque allèle est défini ainsi par la taille du

Dans le document Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé (Page 66-200)