Localisation nucléaire de BAX dans les cellules en culture in vitro

Nos études en immunofluorescence et fractionnement cellulaire ont permis d’identifier in vitro une localisation cytosolique et majoritairement nucléaire de BAX dans les cellules épithéliales alvéolaires (A549) et bronchiques (Beas2B) humaines, ainsi que dans les fibroblastes issus de culture primaire de poumons témoins dans des conditions non-apoptotiques (Figure 34 Control HLF). De la même manière, par immunofluorescence, nous observons une expression cytoplasmique et majoritairement nucléaire de BAX dans les fibroblastes humains de culture primaire provenant de patients atteints de FPI (Figure 34 IPF HLF).

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Figure 34 : Marquage nucléaire de BAX dans les fibroblastes de FPI.

Les fibroblastes primaires humains de patients témoins (Control HLF) et de patients atteints de FPI (IPF HLF) sont incubés avec un anticorps anti-BAX en vert et de la mitochondrie par le Mitotracker red en rouge et sont analysés par immunofluorescence.

Cependant, les mécanismes moléculaires permettant la relocalisation de BAX dans le noyau ainsi que sa fonction n’ont pas été étudiés. Les mécanismes qui régulent cette localisation nucléaire de BAX dans les cellules viables requièrent donc des études plus poussées. En effet, BAX ne possède pas de séquence de localisation nucléaire (NLS), ni de séquence d’export nucléaire (NES) comme la majorité des protéines de la famille BCL2, à l’exception du membre pro-apoptotique BOK et du membre anti- apoptotique A1/BFL-1. Comme mentionné dans l’introduction, le membre pro- apoptotiques BOK humain possède une séquence riche en leucine indiquant un signal d’export nucléaire dans son domaine BH3 (Bartholomeusz et al., 2006). La protéine A1 quant à elle, peut se relocaliser dans le noyau des cellules grâce à une séquence NLS (Somogyi et al., 2001). Cependant, il est possible que la protéine BAX (21kDa) diffuse passivement à travers les pores nucléaires comme les autres petites protéines qui traversent librement l’enveloppe nucléaire à travers les complexes de pores nucléaires (Sorokin et al., 2007). Les protéines BAX seraient ensuite retenues dans le noyau par ces interactions avec ces partenaires nucléaires.

a) BAX est à proximité de la chromatine : rôle dans la transcription ?

L’étude de la localisation sous-cellulaire de BAX par immunofluorescence identifie la protéine BAX au niveau de la matrice nucléaire dans les cellules A549 et les fibroblastes témoins. Par une approche par PLA (« proximity ligation assay »), nous observons que BAX se situe à proximité des marqueurs histones enrichies au niveau des

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promoteurs activement transcrits comme les formes acétylées des protéines d’histone et l’histone H3 triméthylée en lysine 4 (H3K4me3) (Kimura).

Tableau 2 : Résumés des interactions de BAX avec différentes protéines nucléaires.

Les + indiquent l’intensité du signal et neg. (négatif), l’absence de signal par PLA.

Euchromatine Eu/Hétérochromatine Facteurs nucléaires acH3 ++ HP1γ +++ TBP neg. acH4 +++ 3mK9H3 3mK27H3 2mK9K3 ++ neg. neg. P53 neg.

acH2B + KU70 neg.

3mK4H3 +++ Nucléomatrice

3mK36H3 neg. Lamin A/C +++

De manière frappante, BAX n’est pas associé avec l’histone H3 triméthylée en lysine 36 (H3K36me3) qui est enrichie dans le corps des gènes en cours de transcription (Kimura), ainsi qu’avec les marqueurs d’histone enrichis dans les zones de répression génique de l’hétérochromatine comme l’histone H3 triméthymée en lysine 27 (H3K27me3) et diméthylée en lysine 9 (H3K9me2) (Kimura). Le tableau 2 ci-dessus résume l’ensemble des résultats obtenus par approche en PLA. Nos résultats suggèrent pour la première fois à notre connaissance que BAX se trouve à proximité de l’euchromatine, au niveau des régions promotrices de gènes activement transcrits dans les cellules épithéliales et les fibroblastes pulmonaires témoins.

De plus, nous montrons pour la première fois que BAX interagit avec l’hétérochromatine protéine 1 gamma (HP1γ) dans les cellules A549 et les fibroblastes témoins. Nous avons confirmé l’interaction BAX/ HP1γ dans les fibroblastes de FPI par PLA (figure 32). HP1γ est une protéine tout d’abord connue comme principalement associée à des domaines d'hétérochromatine et de répression de gènes. Cependant HP1γ a été récemment impliquée dans la régulation de l'activation des promoteurs de gènes dans les régions d’euchromatine (Kimura). Nous avons confirmé l’interaction

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potentielle de BAX avec HP1γ dans le noyau des fibroblastes de FPI par PLA (figure

35).

Figure 35: Interaction BAX/HP1γ dans les fibroblastes témoins et de FPI.

Analyse des interactions entre BAX et HP1γ par Immunofluorescences dans un test de proximity ligation assay (PLA). Les fibroblastes humains témoins (A, Cont) et de FPI (B, FPI) sont marqués avec des anticorps anit-BAX BD lapin et des anticorps anti-HP1γ souris. Le signal est détecté par un kit Duolink II, les filaments d’actine sont marqués avec un anticorps anti-phalloïdine (rouge) et les noyaux sont marqués avec le DAPI (bleu). Chaque point vert représente la détection d’un complexe d’interaction protéine-protéine.

De plus, nous avons aussi observé que l’expression d’HP1γ était associée à la localisation nucléaire de BAX dans les coupes de poumons de FPI. Ainsi BAX nucléaire pourrait participer activement à la transcription de gènes via son interaction avec HP1γ participant peut être à la régulation du phénotype pro-fibrosant des fibroblastes et à l’hyperprolifération des cellules épithéliales hyperplasiques dans la fibrose pulmonaire. Des études complémentaires du complexe nucléaire BAX et des gènes cibles de ce complexe seront nécessaires pour tester cette hypothèse.

b) D’autres membres de la famille BCL-2 sont présents dans le noyau

Une autre conséquence de la rétention nucléaire de BAX serait de garder la protéine BAX loin du cytoplasme où elle pourrait induire sa fonction apoptotique par relocalisation du cytosol vers la membrane externe de la mitochondrie. Ce mécanisme a été récemment décrit pour la protéine BH3-only BIM. Au cours de l'infection virale de cellules endothéliales immortalisées par l'herpès virus de type 8 (HHV-8), la protéine virale vIRF1 (viral interferon regulatory factors1) interagit avec BIM puis séquestre BIM dans le noyau de l'hôte pour contrecarrer les signaux pro-apoptotiques induits par l'infection (Choi and Nicholas).

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D’autres protéines pro- et anti-apoptotiques membres de la famille Bcl-2 comme BOK, BCL-2 et MCL-1 sont également présentes dans le noyau des cellules viables. Comme mentionné plus haut, il a été montré que BOK via sa séquence NES peut interagir avec CRM1, la protéine Exportin1 nucléaire (récepteur d’export pour les protéines contenant des signaux d’export nucléaire riche en leucine (NES)). BOK a été détectée à la fois dans le noyau et le cytoplasme des cellules 293T HEK, des cellules HeLa et des cellules de cancer du sein. L’accumulation de BOK au niveau nucléaire entraîne l’apoptose des cellules, suggérant un autre mécanisme d’induction de l’apoptose indépendant de la mitochondrie (Bartholomeusz et al., 2006).

De plus, la forme nucléaire de BCL-2, mais pas BAX nucléaire, interagit avec la protéine nucléaire PML (Promyelocytic leukemia protein) dans les cellules MCF-7 (Hoetelmans, 2004). De plus, BCL-2 interagit et stabilise le facteur de transcription HIF-1α dans les noyaux des cellules de mélanome en hypoxie. BCL-2 nucléaire peut former un tri-complexe avec HIF-1α et la protéine chaperonne HSP90 qui protège HIF- 1α de la dégradation par le protéasome dans ces cellules. Cette étude montre un rôle pro-angiogénique de Bcl-2 nucléaire dans les cellules de mélanome (Trisciuoglio et al.). De plus, BCL-2 peut interférer avec les systèmes de réparation de l'ADN conduisant à l'instabilité du génome dans les cellules surexprimant Bcl-2 (Laulier and Lopez). Une autre protéine anti-apoptotique de la famille Bcl-2, MCL-1 a été observée dans le noyau où elle interagit avec PCNA (proliferating cell nuclear antigen), un cofacteur de la polymérase delta de l'ADN dans les cellules HeLa.

Ainsi, plusieurs membres pro- et anti-apoptotiques de la famille BCL-2 (BAX, BOK, BIM, BCL-2, BFL-1S et MCL-1) peuvent être présent dans le noyau des cellules non- apoptotiques. Il reste à découvrir si les complexes d’interactions qui régulent leurs fonctions apoptotiques dans le cytoplasme (Chipuk and Green, 2008) peuvent avoir lieu dans le noyau pour orchestrer diverses fonctions cellulaires non-apoptotiques au cours de la fibrogénèse pulmonaire.

3) Les fonctions non-apoptotiques de BAX : implication dans la